ASTM A790 2507 /2205 1.4462 / 1.4410 tubo saldato duplex per l'industria chimica Componente chimico, la carenza di SPECC1L porta ad una maggiore stabilità delle articolazioni giunte e a una riduzione dello spargimento di cellule di cresta neurale cranica.

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ASTM A790 2507 /2205 1.4462 / 1.4410 tubo saldato duplex per l'industria chimica

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a) OD (diametro esterno): da 3,18 mm a 101,6 mm
b) WT (spessore della parete): da 0,5 mm a 20 mm
c) Lunghezza: secondo i requisiti del cliente
d) standard: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ecc
e) Metodo di processo: ERW, EFW ecc.

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Le cellule di cresta neurale cranica (CNCC) si allontanano dalle pieghe neurali embrionali e migrano verso gli archi faringei, che formano la maggior parte delle strutture a medio.La disfunzione del CNCC svolge un ruolo importante nell'eziologia della fessura orofacciale, una malformazione congenita comune.Mutazioni Specc1L eterozigote sono state trovate in pazienti con fessure atipiche e sindromiche.Qui, riportiamo la colorazione migliorata dei componenti della giunzione dell'adesivo canonico (AJ), della β-catenina e della caderina E in cellule knockdown SPECC1L in coltura e le micrografie elettroniche mostrano una diffusione apicale-basale di AJ.Per comprendere il ruolo di SPECC1L nella morfogenesi craniofacciale, abbiamo creato un modello murino carente di SPECC1L.I mutanti omozigoti sono letali embrionali e presentano una chiusura del tubo neurale compromessa e laminazione CNCC.La colorazione delle proteine ​​AJ è aumentata nelle pieghe neurali mutanti.Questo difetto AJ è coerente con un difetto nella delaminazione del CNCC, che richiede dissoluzione AJ.Inoltre, i mutanti SPECC11 hanno ridotto la segnalazione PI3K-AKT e un aumento dell'apoptosi.In vitro, una lieve inibizione della segnalazione PI3K-AKT nelle cellule di tipo selvaggio era sufficiente per indurre cambiamenti AJ.È importante sottolineare che i cambiamenti di AJ indotti dal knockdown SPECC1L possono essere invertiti dall'attivazione del percorso PI3K-AKT.
Le cellule di cresta neurale cranica (CNCC) si localizzano nel neuroectoderma dorsale e si staccano dal neuroepitelio delle pieghe neurali in via di sviluppo attraverso un processo che coinvolge la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) 1,2,3.I CNCC epiteliali premessi interrompono le giunzioni intercellulari e diventano migranti CNCC mesenchimali che riempiono i primi e i secondi archi faringei e formano gran parte della cartilagine craniofacciale.Pertanto, i geni che regolano la funzione CNCC sono spesso interrotti nell'eziologia delle anomalie congenite craniofacciali come le fessure orofacciali, che colpiscono più comunemente 1/800 nascite negli Stati Uniti.Una delle deformità congenite8.
La delaminazione del CNCC coincide con la chiusura del tubo neurale anteriore tra 8,5 e 9,5 giorni di sviluppo embrionale nei topi.I mutanti di un numero di geni associati alla schisi orofacciale di topo mostrano anche una qualche forma di difetto del tubo neurale, tra cui IRF69,10, GHRL310, CFL111 e PDGFRα12.Tuttavia, i processi di chiusura del tubo neurale e stratificazione del CNCC possono essere considerati indipendenti, poiché il topo mutante sppotch (PAX3) mostra difetti nella chiusura del tubo neurale senza alcun effetto sulla stratificazione della CNCC o sulla migrazione 13,14.Ulteriori modelli di topo con difetti nella dissezione CNCC e nella chiusura del tubo neurale aiuteranno a delineare la base molecolare comune di questi due processi.
L'isolamento del CNCC dalle cellule neuroepiteliali richiede la dissoluzione delle giunzioni adesive (AJ), che sono composti da complessi proteici contenenti, tra gli altri, E-caderina, β-catenina, α-E-catenina e α-actinina associate a filame di actina 2 . Studi di sovraespressione L'e-caderina nelle pieghe neurali ha mostrato una riduzione o un ritardo nella delaminazione del CNCC.Al contrario, la soppressione della E-caderina provoca stratificazione precoce15,16.Molti dei fattori che mediano EMT durante la stratificazione del CNCC sono fattori di trascrizione (AP2α, ID2, FoxD3, Snail, Twist, SOX10) ed Extracellular Matrix (ECM) che rimodellano le proteine ​​di AJ a matrice come le regolatori AJ di matrice (MMP) non ancora noto.È noto che il percorso PI3K-AKT è noto per antagonizzare i livelli di E-caderina, principalmente da Cancer Research17.Recenti studi hanno dimostrato che la perdita di segnalazione PI3K-AKT a base di PDGFα nei topi porta a anomalie craniofacciali, tra cui palatoschisi e difetti del tubo neurale12.Tuttavia, la relazione tra il percorso PI3K-AKT e la stabilità di AJ sulla stratificazione CNCC non è chiara.
In precedenza abbiamo identificato SPECC1L come il primo gene mutante in due persone con una grave fessura che si estende dalla bocca all'occhio, noto come schisi obliqua (OBFC) o Tessier IV18 schisi.Le mutazioni SPECC1L sono state identificate in due famiglie multigenerazionali con la sindrome di Opitz G/BBB autosomica dominante (OMIM #145410), in cui gli individui colpiti hanno mostrato iperdistanza e labbro/palatosato19, e in una famiglia con sindrome da sovradistruzione tibi (OMIM #145420) 20 .Più della metà dei casi di sindrome di Opitz G/BBB sono legati a X (OMIM #300000) e sono causati da mutazioni nel gene Mid1, che codifica la proteina 22 dello scheletro cellulare associato al microtubulo.Ipotizziamo che SPECC1L, anche una proteina associata ai microtubuli e al citoscheletro di actina, possa mediare la segnalazione richiesta per il rimodellamento del citoscheletro di actina durante l'adesione cellulare e la migrazione 18.Attraverso studi in vitro e in vivo, ora descriviamo SPECC1L come un nuovo regolatore della stabilità di AJ attraverso la segnalazione PI3K-AKT.A livello cellulare, la carenza di SPECC1L ha comportato una diminuzione del livello della proteina Pan-AKT e un aumento della dispersione apicale-basale di AJ, che è stata eliminata dall'attivazione chimica della via Akt.In vivo, gli embrioni con deficit di Specc11 mostrano una chiusura alterata del tubo neurale e una riduzione della dissezione CNCC.Pertanto, le funzioni SPECC1L nella segnalazione basata sull'adesione cellulare altamente regolamentate richieste per la normale funzione CNCC durante la morfogenesi facciale.
Per caratterizzare il ruolo di SPECC1L a livello cellulare, abbiamo usato la linea cellulare di osteosarcoma stabile precedentemente descritta U2OS carente in SPECC1L18.Queste cellule U2OS stabili con knockdown SPECC1L (KD) hanno avuto una riduzione moderata (60-70%) nei livelli di trascrizioni e proteine ​​SPECC1L, insieme a difetti nella migrazione e nella riorganizzazione del citoscheletro di actina 18. Al contrario, un grave diminuzione transitoria in Specc1l ha dimostrato di portare a difetti mitotici 23.Dopo un'ulteriore caratterizzazione, abbiamo scoperto che le nostre cellule SPECC1L-KD stabili hanno cambiato la morfologia a un grado molto elevato di confluenza (Figura 1).Le singole cellule di controllo e le cellule KD a bassa confluenza sembravano simili (Figura 1A, D).24 ore dopo la fusione, le cellule di controllo hanno mantenuto la loro forma cuboidale (Fig. 1B, E), mentre le cellule SPECC1L-KD sono allungate (Fig. 1C, F).L'entità di questo cambiamento nella forma cellulare è stata catturata dall'imaging in diretta in vivo delle cellule di controllo e delle cellule KD (film 1).Per determinare il ruolo di SPECC1L nelle cellule confluenti, abbiamo prima esaminato la sua espressione.Abbiamo scoperto che i livelli di proteina SPECC1L sono aumentati dopo la fusione (Figura 1G), mentre i livelli di trascrizione di SPECC1L non sono aumentati (Figura 1H).Inoltre, con l'aumentare della densità cellulare, la proteina SPECC1L si è accumulata a confini intercellulari (Fig. 2A-E), con un modello che si sovrappone a quello della β-catenina associata alla membrana (Fig. 2a'-e ').Data l'associazione di SPECC1L con il citoscheletro di actina 18,23, abbiamo ipotizzato che SPECC1L interagisca con le giunzioni adesive a base di actina (AJ).
(AF) Le cellule di knockdown SPECC1L (DF) si allungano ad alta confluenza (F) rispetto alle cellule di controllo U2OS (AC).Qui sono mostrati tre dei sei punti temporali (T1, T3, T6) che abbiamo selezionato per diverse densità cellulari.(G) Analisi Western blot che mostra che la proteina SPECC1L è stabilizzata ad un alto grado di confluenza rispetto a un basso grado di confluenza nelle cellule di controllo.Western blot di SPECC1L mostra la banda di 120 kDa prevista e una banda di peso molecolare più elevata, possibilmente modificata post-traduzionale (*).L'analisi Western Blot è stata eseguita nelle stesse condizioni per la bassa e alta confluenza.Le immagini che mostrano SPECC1L a bassa e alta confluenza sono state prelevate dalla stessa macchia.La stessa macchia è stata rimossa e riesaminata con anticorpo β-actina.(H) L'analisi quantitativa RT-PCR non ha mostrato cambiamenti significativi nei livelli di trascrizione SPECC1L.Le barre di errore rappresentano SEMS di quattro esperimenti indipendenti.
(AE) Abbiamo scelto sei punti temporali (T1-T6) che rappresentano un intervallo di densità cellulari per normalizzare l'analisi della forma cellulare e i cambiamenti di AJ nelle cellule U2OS con knockdown SPECC1L (KD).I primi cinque di questi punti temporali includevano singole celle (T1), fusione del 50-70% di cluster di piccole cellule (T2), fusione senza rimodellare le cellule KD (T3), rimodellare le celle KD (T4) e 24 ore.Nella forma posteriore di cellule KD (T5).(FJ) La β-catenina mostra un accumulo simile a confini intercellulari associati al complesso AJ.(A'-E ') SPECC1L e β-catenina mostrano una colorazione sovrapposta ai bordi cellulari ad alta densità cellulare (frecce).(F'-J') In SPECC1L-kd cells, β-catenin staining appears normal at low cell density (F'-H'), but expands as cell shape changes (I', J'; arrows), indicating that AJ è cambiato.Barre = 10 µm.
Abbiamo quindi cercato di determinare l'effetto della carenza di SPECC1L su AJ.Abbiamo usato diversi marcatori associati ad AJ, tra cui i componenti canonici F-actina, miosina IIB, β-catenina e E-caderina24,25,26,27.Le fibre di stress da actina sono aumentate nelle cellule SPECC1L-KD come precedentemente descritto (Fig. 3A, B) 18.La miosina IIB associata ai filamenti di actina ha mostrato un aumento simile nelle cellule SPECC1L-KD in vitro (Fig. 3C, D).La β-catenina associata a AJ si lega alla caderina sulla membrana cellulare, mostrando un normale modello di espressione di "nido d'ape" nei cubociti di controllo (Fig. 3E, G).È interessante notare che nelle immagini piatte usando microscopia confocale, β-catenina (Fig. 3E, F) e E-caderina (Fig. 3G, H) colorazione sulla membrana cellulare di cellule confluenti con deficit di Specc1l hanno mostrato modelli prominenti di colorazione estesa.Questa espansione della colorazione β-catenina associata ad AJ nelle cellule KD è stata più pronunciata alla confluenza, ma sembrava precedere i cambiamenti della forma cellulare (Fig. 2f-J, f'-j ').Per determinare la natura fisica di questa colorazione AJ estesa, abbiamo esaminato i bordi cellulari sulla superficie apicale-basale delle cellule U2OS SPECC1L-KD mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (Figura 3i, J).Contrariamente alle cellule di controllo (Fig. 3i), che avevano regioni dense di elettroni separate indicative di AJ (frecce), le celle KD (Fig. 3J) hanno mostrato grandi regioni contigue di alta densità elettronica indicativa di AJ lungo il piano apicobasale..Inoltre, su sezioni trasversali, abbiamo osservato estese pieghe di membrana cellulare nelle cellule KD (Fig. S1A, B), che spiega il modello esteso di bande di colorazione della β-catenina e della caderina E (Fig. 3F, H).A supporto del ruolo di SPECC1L in AJS, la β-catenina è stata co-immunoprecipitata con SPECC1L nei lisati di cellule Confluenti U2OS (Fig. 3K).Insieme all'immunocolorazione estesa per i marcatori AJ, l'analisi TEM era coerente con la nostra ipotesi che la carenza di SPECC1L aumenti la densità e la varianza AJ apical-basale.
(AH) ha aumentato la colorazione F-actina nelle cellule KD a 48 ore dopo la fusione (T6; A, B).Colorazione alterata della miosina IIB associata a F-actina (C, D).Il modello liscio di colorazione della membrana β-catenina e E-caderina nelle cellule di controllo (E, G) è stato migliorato nelle cellule SPECC1L-KD (F, H).Barre = 10 µm.(I-J) Micrografie elettroniche che osservano la giunzione intercellulare apicale-basale.Le celle di controllo mostrano regioni distinte densi di elettroni che indicano giunzioni appiccicose (I, frecce).Al contrario, l'intera giunzione apicale-basale nelle celle SPECC1L-KD appariva densa elettronica (J, frecce), indicando una maggiore densità e dispersione di giunzioni adesive.(K) La β-catenina è stata co-immunoprecipitata con SPECC1L nei lisati cellulari U2OS confluenti.Immagine presa da un punto che rappresenta uno dei quattro esperimenti indipendenti.
Per comprendere il ruolo di SPECC1L nella morfogenesi craniofacciale, abbiamo creato un modello murino carente di SPECC1L usando due linee cellulari ES TRAP indipendenti, DTM096 e RRH048 (Baygenomics, CA), che rappresentano le trascrizioni di Intron 1 e Specc1L sono state catturate a 15 (Fig. 1) .4A, Figura S2).La posizione genomica dell'inserto vettoriale di esca è stata determinata dal sequenziamento dell'intero genoma e confermata dalla PCR (Fig. S2).Entrambi i progetti di trappole genici hanno anche consentito la fusione in frame dei giornalisti SPECC11-Lacz al momento della cattura.Pertanto, l'espressione di LACZ determinata dalla colorazione X-GAL è stata usata come indicatore dell'espressione di SPECC11.Entrambi gli alleli hanno mostrato modelli di espressione di LACZ simili, con la trap del gene DTM096 nell'introne 1 che mostra un'espressione più forte di RRH048 nell'introne 15 (non mostrato).Tuttavia, SPECC1L è ampiamente espresso, con un'espressione particolarmente forte nelle pieghe neurali a E8.5 (Figura 4B), nel tubo neurale e nei processi facciali a E9.5 ed E10.5 (Figura 4C, D) e nello sviluppo degli arti a E10.5 e occhi (Figura 4D).In precedenza abbiamo riferito che l'espressione di SPECC1L nel primo arco faringeo a E10.5 era presente nell'epitelio e nell'epitelio e nel sottostante mesenchima18, in linea con il lignaggio CNCC.Per testare l'espressione di SPECC1L in CNCC, abbiamo eseguito le pieghe neurali E8.5 (Figura 4E-J) ed E9.5 sezioni del cranio (Figura 4K-).A E8.5, Specc1L colorate le pieghe neurali intensamente (Fig. 4e, H), comprese le cellule colorate con marcatori NCC (Fig. 4G, J).A E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) colorato in modo fortemente colorato di CNCC con AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Rappresentazione schematica del gene Specc11 del topo che mostra l'inserimento del vettore di esca in ES DTM096 (Intron 1) e RRH048 (introne 15) cloni cellulari.(BD) Colorazione LACZ di embrioni eterozigoti SPECC1LDTM096 che rappresentano l'espressione di SPECC1L da E8.5 a E10.5.NE = neuroectoderm, nf = piega neurale, PA1 = primo arco faringeo.(EP) SPECC1L Immunocolorazione con marcatori NCC AP2A e SOX10 in E8.5 (NF; EJ) Foldie neurali e sezioni del cranio E9.5 (KP).La colorazione SPECC1L è stata ampiamente osservata nelle pieghe neurali E8.5 (E, H; freccia), comprese le cellule etichettate con AP2A (F, G; punte di freccia) e SOX10 (I, J; punte di freccia).A E9.5, SPECC1L ha fortemente colorato i CNCC migratori (K, N; frecce) etichettati AP2A (L, M; frecce) e SOX10 (O, P; frecce).
L'incrocio tra i topi eterozigoti Specc1LDTM096/+ e SPECC1LRRH048/+ mostra che gli alleli di due trappole genici non sono complementari e che eterozigoti composti e omozigoti embrionali per entrambi gli alleli di trappola embrionali (Tabella S1).I rapporti mendeliani hanno indicato una diminuzione del tasso di sopravvivenza degli eterozigoti alla nascita (prevista 1,34 contro 2,0).Abbiamo notato una bassa mortalità perinatale tra gli eterozigoti, alcuni avevano anomalie craniofacciali (Fig. S3).Tuttavia, la bassa penetranza di questi fenotipi craniofacciali perinatali rende difficile studiare i loro meccanismi patofisiologici sottostanti.Pertanto, ci siamo concentrati sul fenotipo letale embrionale dei mutanti omozigoti Specc11.
La maggior parte degli embrioni mutanti eterozigoti e omozigoti composti non si sono sviluppati dopo E9.5-10,5 (Figg. 5A - D) e il tubo neurale non si è chiuso anteriormente (Figg. 5b, d) e talvolta chiuso posteriore (non mostrato) ..Questo difetto di chiusura del tubo neurale cranico era associato alla maggior parte del CNCC contrassegnato da DLX2 rimasto nelle pieghe neurali a E10.5, indicando nessuna dissezione (Figura 5a'-d ').Per determinare se anche la dimensione complessiva di CNCC è stata ridotta, abbiamo taggato le linee CNCC con GFP nelle nostre linee di trappola genica con Wnt1-CRE e Rosamtmg.Abbiamo trasmesso in streaming GFP+ NCC e GFP- (RFP+) non NCC da interi embrioni.A E9.5, la proporzione di CNCC marcati con GFP senza flusso non è cambiata significativamente tra embrioni WT e mutanti (non mostrati), indicando le normali specifiche CNCC.Pertanto, abbiamo ipotizzato che la colorazione residua di Wnt1-CRE e DLX2 nelle pieghe neurali esposte (Figura 5B ') fosse dovuta alla stratificazione CNCC difettosa, probabilmente a causa dell'aumento della densità o della dispersione delle cellule AJ, come si vede nelle cellule SPECC1L-KD.Abbiamo usato i marcatori NCC SOX10, AP2A e DLX2 per confermare la presenza di CNCC nella piega neurale (Figura 5E-R).A E8.5, la colorazione della piega neurale per tutti e tre i marcatori NCC è stata osservata in sezioni di WT (Fig. 5E, G, I) e SPECC1L mutante (Fig. 5F, H, J).A E9.5, mentre i marcatori NCC hanno colorato la migrazione NCC nelle sezioni WT (Fig. 5M, O, Q), è stata osservata una colorazione NCC residua nelle pieghe neurali esposte di embrioni mutanti SPECC1L (Fig. 5N, P, R).Poiché il segnale di migrazione dei CNCC migrali SOX10 e DLX2, questo risultato suggerisce che i CNCC con deficit di SPECC1L ottengono specifiche post-migratorie ma non riescono a migrare dalle pieghe neurali.
La carenza di SPECC11 porta alla chiusura difettosa del tubo neurale, alla delaminazione di cellule di cresta neurale cranica e AJ.
(A, B ') E9.5 WT (A) Embrione che trasporta cellule di cresta neurale cranica migrante (CNCC) etichettate con Wnt1-Cre (A').Al contrario, gli embrioni mutanti SPECC11 mostrano pieghe neurali aperte (B), punte di freccia) e CNCC che non sono emigrati (B ', punte di freccia).(C, d ') immagini di campo luminoso (c, d') e immunostaining (c ', d') del marcatore CNCC DLX2 degli embrioni E10.5 WT (C, C ') e SPECC1L (D, D').Negli embrioni WT E10.5, il CNCC positivo a DLX2 colonizza gli archi di branchie (C ', frecce), mentre nei mutanti, la cospicua colorazione persiste nelle pieghe neurali aperte (d', frecce) e nei primi archi faringei (d ', frecce).) con alcune colorazioni (frecce) che indicano una scarsa delaminazione e la migrazione del CNCC.ER) Sezioni di embrioni mutanti WT e SPECC1L nelle fasi E8.5 (E - L) ed E9.5 (M - R) sono state etichettate con marcatori NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) e Dlx2 (I, J, Q, R).A E8.5, la colorazione NCC è stata osservata in sezioni neurali di tipo selvaggio (NF) e sezioni mutanti.La colorazione di SOX10 e β-catenina in E8.5 WT (K) e mutante (L) ha rivelato un aumento della colorazione della β-catenina ai confini delle cellule nelle pieghe neurali.A E9.5, è stata osservata una colorazione wild-type di CNCC migranti (M, O, Q), mentre nei mutanti, CNCC non stratificati colorati di pieghe neurali aperte (N, P, R).(S - Z) Analisi di etichettatura AJ in vivo in sezioni coronali di embrioni WT e SPECC11DTM096/RRH048 con la mutazione E9.5.Un piano sezionale approssimativo è mostrato nell'angolo in alto a destra.In sezioni di tessuti mutanti, è stata osservata una maggiore colorazione di F-actina (S, T) e miosina IIB (U, V).Simile ai risultati in vitro in Fig. 3, negli embrioni mutanti, è stata osservata una colorazione di membrana migliorata per la β-catenina (W, X) e la caderina E (Y, Z).(AA-BB) Una microfotografia elettronica di una sezione di un embrione di tipo selvaggio che guarda oltre il bordo della cella apicale-basale mostra una distinta regione densa elettronica indicativa di giunzioni adesive (AA, frecce).Al contrario, nelle sezioni degli embrioni mutanti SPECC11 (BB, frecce), l'intera giunzione apicobasale è densa elettronica, indicando una maggiore densità e dispersione di giunzioni adesive.
Per testare la nostra ipotesi che una ridotta stratificazione sia dovuta a AJ alterata, abbiamo esaminato l'etichettatura AJ nelle pieghe neurali esposte di embrioni mutanti SPECC1L (Fig. 5S-Z).È importante sottolineare che abbiamo osservato un aumento della colorazione della β-catenina (Fig. 5W, X) ed E-caderina (Fig. 5y, Z) ai confini intercellulari.Abbiamo anche esaminato la colorazione della β-catenina di NCC nelle pieghe neurali degli embrioni E8.5 (Fig. 5K, L).La colorazione della β-catenina sembrava essere più forte nelle pieghe neurali mutanti SPECC1L (Fig. 5L e K), suggerendo che erano iniziate i cambiamenti di AJ.
Le vescicole subepidermiche sono un segno distintivo della ridotta segnalazione PI3K-AKT basata su PDGFRα12.Fantauzzo et al.È stata osservata una riduzione in vitro solo quando le cellule U2OS erano fortemente confluenti con cambiamenti nella forma cellulare e nella densità di AJ (Figura 6D).Pertanto, i nostri dati suggeriscono che SPECC1L è un nuovo regolatore positivo della segnalazione PI3K-AKT nella morfogenesi craniofacciale.
(A-E) E8.5 (A, B) ed E9.5 (C, D) sezioni del cranio o lisati E9.5 da embrioni mutanti SPECC1L (E) che mostrano livelli di riduzione della proteina S473-AKT e PAN-AKT attiva , rispetto al controllo WT.Western blotting è stato eseguito su lisati di tipo selvaggio e lisati mutanti nelle stesse condizioni.Le immagini mostrate per SPECC1L sono state prelevate da una macchia.La stessa macchia è stata rimossa e riesaminata con anticorpi anti-Pan-ACT e β-actina.I livelli di Pan-AKT nelle pieghe neurali E8.5 (A, B) e i livelli di S473-AKT fosforilati nelle sezioni del cranio E9.5 sono stati significativamente ridotti.(F) I livelli di Pan-AKT sono stati ridotti in modo simile nei lisati delle cellule U2OS SPECC1L-KD raccolte ad alta confluenza.Le barre di errore rappresentano SEMS da tre quantificazioni indipendenti di Western Blot.(GJ) Sezioni di embrioni WT a E9.5 colorate con Ki67 e caspasi 3, rispettivamente, mostrando proliferazione cellulare (G, G ') e poca attività apoptotica (H, H').Gli embrioni mutanti SPECC11 mostrano proliferazione cellulare comparabile (I), ma il numero di cellule sottoposte a apoptosi è significativamente aumentato (J).
Abbiamo quindi esaminato i marcatori di proliferazione e apoptosi.We did not observe any difference in the proliferation of E9.5 embryos (Fig. 6E, G compared to I) with a proliferation index of 82.5% for WT mutants and 86.5% for Specc1l mutants measured by KI67 staining (p <0.56, Fisher's Test esatto).Al contrario, l'apoptosi è stata significativamente aumentata in tutti gli embrioni mutanti E9.5 (Fig. 6F, H e J).Questo aumento complessivo dell'apoptosi è coerente con la ridotta segnalazione PI3K-AKT e la letalità embrionale precoce29,30,31.
Successivamente, per confermare un ruolo causale per la segnalazione PI3K-AKT nelle variazioni di AJ nelle nostre cellule KD, abbiamo modificato chimicamente il percorso in controllo e cellule KD (Figura 7A-F).Abbiamo usato come marcatore il fenotipo di cambio di cellula osservato nelle cellule confluenti SPECC1L-KD, che abbiamo quantificato usando il rapporto tra dimensione più lunga (lunghezza) e dimensione verticale corrispondente (larghezza).È previsto un rapporto di 1 per cellule relativamente rotonde o cuboidali (Figura 7G).Oltre alla forma cellulare, abbiamo anche confermato l'effetto su AJ mediante colorazione β-catenina (Fig. 7a'-f ').L'inibizione della via PI3K-AKT usando Wortmannin era sufficiente per cambiare la forma cellulare nelle cellule di controllo (Figura 7A, C) e AJ (Figura 7A ').L'attivatore PI3K-AKT SC-79 non ha influenzato l'espansione della forma cellulare (Fig. 7A, E) o AJ (Fig. 7A ') nelle cellule di controllo.Nelle cellule SPECC1L-KD, l'ulteriore soppressione della via PI3K-AKT ha comportato un aumento dell'apoptosi (Fig. 7B, D) e un marcato aumento della colorazione della β-catenina (Fig. 7B '), coerente con i nostri mutanti pesanti in vivo.È importante sottolineare che l'attivazione della via PI3K-AKT ha migliorato significativamente la forma cellulare (Figura 7B, F) e Fenotipi AJ (Figura 7B ”).I cambiamenti nella forma cellulare sono stati quantificati come rapporto di rotondità cellulare (CCR) e confrontati per il significato come descritto sopra (Fig. 7G).Infatti, nelle cellule di controllo (Fig. 7G, CCR = 1,56), il trattamento di Wortmannin era sufficiente per alterare significativamente la forma cellulare (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) nella misura simile a quella osservata in SPECC1L.-kd cellule (Fig. 7G, CCR = 3.46).Il trattamento di Wortmannin delle cellule SPECC1L-KD (Fig. 7G, CCR = 3,60, trascurabile) non era più significativo delle cellule KD non trattate (Fig. 7G, CCR = 3,46, trascurabile) o cellule di controllo trattate da Wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3.46, trascurabile) influisce inoltre l'allungamento cellulare (7G, CCR = 3.61, trascurabile).Ancora più importante, l'attivatore AKT SC-79 ha ripristinato il fenotipo allungato delle cellule SPECC1L-KD (Fig. 7G, CCR = 1,74, P <6,2 × 10-12).Questi risultati confermano che SPECC1L regola la segnalazione PI3K-AKT e suggeriscono che una moderata riduzione di SPECC1L influisce sull'adesione cellulare, mentre una forte riduzione porta all'apoptosi (Fig. 8).
(A-F ') COLLE CONTROLLO (A, C, E) e SPECC1L-KD (B, D, F) trattate con il trattamento con inibitore della via PI3K-AKT Wortmannin (C, D) o SC-79 Activator (E, F) Le cellule di controllo non trattate sono cuboidali (A) con normale colorazione cellulare β-Cat (A '), mentre le cellule KD sono allungate (B) con aumento della colorazione β-Cat (B').Dopo la soppressione della via PI3K-AKT, le cellule di controllo si sono allungate (C) con espansione β-CAT (C '), mentre le cellule KD hanno iniziato a sottoporsi a apoptosi (D), simili ai nostri embrioni altamente mutati e mostrando β-CAT estremamente migliorato.colorazione (d ').Dopo l'attivazione della via PI3K-AKT, le cellule di controllo sono rimaste cuboidali (E) e avevano una normale colorazione β-cat (E '), mentre le cellule KD hanno mostrato una colorazione di forma cellulare (F) e β-cat (F') significativamente migliorata (G) Il grado di variazione della forma cellulare in (AF) è stato quantificato usando il rapporto di rotondità cellulare (CCR) della dimensione più lunga (lunghezza) e la corrispondente dimensione verticale (larghezza) utilizzando il software Metamorph.Le cellule SPECC1L-KD non trattate (NT) (CCR = 3,46) erano significativamente più lunghe rispetto alle cellule di controllo (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).L'inibizione di Wort della via PI3K-AKT nelle cellule di controllo era sufficiente per causare un simile allungamento della forma cellulare (CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9).Allo stesso modo, l'attivazione di Akt da parte di SC-79 nelle cellule SPECC1L-KD ha ripristinato l'allungamento delle cellule ai livelli di controllo (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Il trattamento con wortmannina delle cellule SPECC1L-KD ha comportato un aumento dell'apoptosi ma nessun ulteriore aumento della variazione della forma cellulare (CCR = 3,60) rispetto al KD non trattato (CCR = 3,46, NS) o cellule di controllo trattate con Wortmannin (3,61) osservate.ns = non importa.Vengono mostrate le misurazioni +/- SEM per 50 cellule.Le differenze statistiche sono state calcolate usando il test t di Student.
(A) Rappresentazione schematica dell'inibizione e dell'attivazione del percorso PI3K-AKT con conseguenti cambiamenti di AJ e salvataggio, rispettivamente.(B) Modello proposto per la stabilizzazione della proteina Akt da SPECC1L.
I CNCC premigrativi richiedono che AJ lisi separasse dalle cellule neuroepiteliali della piega neurale anteriore1,15,32.Aumentata colorazione dei componenti AJ e perdita della distribuzione asimmetrica AJ apicale nelle cellule con deficit di Specc1l sia in vitro che in vivo, combinate con la vicinanza fisica di SPECC1L a β-catenina, suggerisce che Specc1l funziona correttamente per mantenere la stabilità locale di AJ per muscoli dell'organizzazione.citoscheletro di actina.L'associazione di SPECC1L con il citoscheletro di actina e la β-catenina e l'aumento del numero di filamenti di actina condensati in assenza di SPECC1L è coerente con l'aumento osservato della densità AJ.Un'altra possibilità è che un aumento del numero di fibre di actina nelle cellule con deficit di SpecC1L porti a un cambiamento nella tensione intercellulare.Poiché lo stress cellulare influisce sulla dinamica AJ 33, le variazioni di tensione possono causare AJ 34 più diffuse.Pertanto, eventuali modifiche influenzerà gli strati CNCC.
Wnt1 è espresso nelle prime pieghe neurali che danno origine alle cellule di cresta neurale.Pertanto, il tracciamento del lignaggio Wnt1-CRE segna sia NCC35 pre e migrazione.
I nostri dati suggeriscono che la regolazione molecolare di AJ da parte di SPECC1L è mediata dalla segnalazione PI3K-AKT.La segnalazione Akt è ridotta in cellule e tessuti carenti di SPECC1L.Risultati di Fantauzzo et al.Supportare un ruolo diretto per la segnalazione di PI3K-AKT nella morfogenesi craniofacciale.(2014) hanno mostrato che la mancanza di attivazione della segnalazione PI3K-AKT a base di PDGFRα porta a un fenotipo del palatoschisi.Mostriamo anche che l'inibizione della via PI3K-AKT è sufficiente per cambiare la forma di AJ e cellulare nelle cellule U2OS.Coerentemente con i nostri risultati, Cain et al.37 ha mostrato che la downregulation della subunità PI3K α110 nelle cellule endoteliali provoca un aumento simile della colorazione pericellulare di β-catenina, indicata come un aumento dell '"indice di connettività".Tuttavia, nelle cellule endoteliali i cui filamenti di actina sono già altamente organizzati, la soppressione della via PI3K-AKT provoca una forma cellulare sciolta.Al contrario, le cellule U2OS SPECC1L-KD hanno mostrato una forma cellulare allungata.Questa differenza può essere specifica del tipo di cella.Mentre la soppressione della segnalazione PI3K-AKT colpisce permanentemente il citoscheletro di actina, l'effetto sulla forma cellulare è determinato dai cambiamenti nella tensione causati da cambiamenti nella densità e dall'organizzazione delle fibre di actina centrale.Nelle cellule U2OS, abbiamo usato solo i cambiamenti della forma cellulare come marker di cambiamento e recupero AJ con deficit di Specc1l.In conclusione, ipotizziamo che l'inibizione della via Akt nella carenza di SPECC1L aumenti la stabilità di AJ e riduca la delaminazione nel CNCC.
È interessante notare che i livelli di pan-AKT sono stati ridotti in vitro e in vivo oltre ai livelli di 473-AKT fosforilati in assenza di SPECC1L, suggerendo la regolazione della segnalazione di PI3K-AKT a livello di stabilità della proteina Akt o turnover.I geni SPECC1L e Mid1, entrambi associati alla sindrome da Opitz/GBBB, codificano per le proteine ​​che stabilizzano i microtubuli 18,22.Il meccanismo con cui SPECC1L e Mid1 mediano la stabilizzazione dei microtubuli non è completamente compreso.Nel caso di SPECC1L, questa stabilizzazione include l'acetilazione migliorata di un sottoinsieme di microtubuli 18.È possibile che SPECC1L utilizzi un meccanismo simile per stabilizzare altre proteine ​​come Akt.È stato dimostrato che l'acetilazione dei residui di lisina nella proteina Akt porta a una diminuzione della localizzazione della membrana e della fosforilazione38.Inoltre, per la localizzazione e l'attivazione della membrana e attivazione 39,40 sono necessari ubiquitination della catena K63 allo stesso residuo di lisina su Akt.Tra i numerosi fattori che interagiscono con le proteine ​​SPECC1L identificate in vari schermi a due ibridi di lievito ad alto rendimento, quattro-CCDC841, ECM2942, APC e UBE2I43-sono stati implicati nel turnover o nella stabilità delle proteine ​​tramite ubiquitinazione o sumoilazione.SPECC1L può essere coinvolto nella modifica post-traduzionale dei residui di lisina AKT, che colpisce la stabilità di Akt.Tuttavia, il ruolo critico di SPECC1L nella localizzazione e nella stabilità della proteina Akt rimane da chiarire.
Difetti gravi nell'espressione di SPECC1L in vivo hanno portato all'aumento della colorazione del marker AJ e alla sovrapposizione di CNCC difettosa, nonché all'aumento dell'apoptosi e alla letalità embrionale precoce.Precedenti rapporti hanno dimostrato che i mutanti di topo con aumento dei livelli di apoptosi sono associati a difetti del tubo neurale 44,45,46,47 e difetti craniofacciali48.È stato suggerito che un'eccessiva morte cellulare nelle pieghe neurali o negli archi faringei può causare un numero insufficiente di cellule richieste per il corretto movimento morfogenetico 48,49,50.Al contrario, le nostre linee cellulari carenti di SPECC1L con espressione di SPECC1L moderatamente ridotte hanno mostrato solo cambiamenti di AJ senza evidenza di aumento della morte cellulare.Tuttavia, l'inibizione chimica della via PI3K-AKT in queste cellule KD ha comportato un aumento dell'apoptosi.Pertanto, una moderata riduzione dell'espressione o della funzione di SPECC1L garantisce la sopravvivenza cellulare.Ciò è coerente con l'osservazione che rari embrioni mutanti SPECC11 che sfuggono all'arresto a ST.E9.5 - forse a causa della ridotta efficienza della cattura genica - è in grado di chiudere i loro tubi neurali e fermarsi più tardi nello sviluppo, spesso con difetti craniofacciali (Fig. S3).Inoltre, è anche coerente con ciò la rara evorizzazione di embrioni eterozigoti Specc1L con anomalie craniofacciali - probabilmente a causa dell'aumento dell'efficienza della cattura genica - così come la scoperta nel pesce zebra in cui uno dei due ortologhi Specc1l (Specc1LB) provoca fenotipi embrionali tardivi, compresa la perdita di perdita di perdita di perdita di perdita di zebra Jaws inferiori e schisi bilaterali51.Pertanto, le mutazioni di perdita di funzione SPECC1L eterozigote identificate nei pazienti umani possono causare piccoli menomazioni nella funzione SPECC1L durante la morfogenesi craniofacciale, sufficiente per spiegare le loro fessure orofacciali.La regolazione basata su SPECC1L dei contatti intercellulari può anche svolgere un ruolo nella palatogenesi e nella fusione degli archi faringei.Ulteriori studi sulla funzione SPECC1L aiuteranno a chiarire il ruolo dei contatti intercellulari temporanei nel CNCC durante la chiusura del tubo neurale nella motilità delle cellule neuroepiteliali e nella morfogenesi craniofacciale.
Il controllo dell'osteosarcoma U2OS e le cellule SPECC1L-KD sono state descritte in precedenza (Saadi et al., 2011).Anche gli anticorpi contro SPECC1L sono stati caratterizzati in precedenza (Saadi et al., 2011).Anticorpi anti-β-catenina (coniglio; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (topo; 1: 1000; Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA), miosina IIB (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ? , California), DLX2 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA), Phospho-Ser473-Akt (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Pan-Akt (1: 1000; Thermofisher Scientific, Waltham, MA ? Mo) è stato usato come descritto..I filamenti di actina sono stati colorati con falloidina di rodamina atmosferica (citoscheletro, Denver, Colorado).
Le cellule di controllo degli U2OS e le cellule SPECC1L-KD sono state coltivate in DMEM ad alto glucosio standard integrati con siero bovino fetale al 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Per i cambiamenti di AJ, 2 cellule x 105 sono state seminate su vetro trattati con gelatina suina allo 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e osservate per cambiamenti nella forma cellulare.Le cellule sono state raccolte in diversi punti temporali indicati: 4 ore dopo la semina (t = 1), 24 ore dopo la semina (t = 2), la confluenza senza cambiamento nella forma cellulare (t = 3), il cambiamento della forma cellulare (t = 4) , 24 h dopo il cambiamento della forma cellulare (t = 5) e 48 ore dopo il cambiamento della forma cellulare (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Per modulare il percorso PI3K-AKT, le cellule sono state coltivate alle concentrazioni indicate con l'inibitore PI3K-AKT Wortmannin (Tocris Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o SC-79 Activator (Tocris Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Il mezzo contenente le sostanze chimiche è stato modificato ogni giorno.
Le registrazioni frame per cornici sono state effettuate sul controllo dal vivo e le cellule KD in condizioni di coltura normali e le immagini di contrasto di fase venivano raccolte ogni 10 minuti per 7 giorni.Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito IRB Leica DM controllato da computer dotato di uno stadio meccanico e un obiettivo di piano N 10 × collegato a una fotocamera QIMAGING REGA-SRV.Durante l'imaging, le colture cellulari sono state mantenute a 37 ° C in un'atmosfera umida con CO2 al 5%.
Sono state utilizzate due linee cellulari di trappole geniche DTM096 e RRH048 dal centro di risorse del topo mutante regionale (UC Davis, CA) per generare linee di topo carenti di SPECC11, designate Specc1lgtdtm096 e Specc1lgtrrh046.In breve, le cellule 129/REGE sono state iniettate in blastocisti C57BL6.I topi maschi chimerici risultanti sono stati allevati con topi femminili C57BL6 per identificare la prole con la colorazione del mantello Agouti.La presenza di inserti vettoriali trappola genica è stata utilizzata per identificare gli eterozigoti.I topi sono stati mantenuti su uno sfondo misto di 129/rej; C57BL6.La posizione del sito di inserzione del vettore di trappola genetica è stata confermata da RT-PCR, sequenziamento del genoma e complementazione genetica (Figura 1 supplementare).Per tracciare il lignaggio CNCC di topi a doppia eterozigote Specc1lgt, Rosamtmg (#007576) e Wnt1-Cre (##003829) sono stati attraversati per produrre i rosamtmg e wnt1-cre allele in embrioni mutanti.Tutti gli esperimenti nei topi sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro medico dell'Università del Kansas.
Gli embrioni sono stati fissati in (1% di formaldeide, 0,2% di glutaraldeide, 2 mM MGCL2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) per 60 minuti a temperatura ambiente.Dopo la fissazione in soluzione di colorazione X-gal (ferricianuro di potassio da 5 mm, ferrocianuro di potassio da 5 mm, 2 mM MGCL2, deossicolato di sodio 0,01%, 0,02% NP-40, 1 mg/ml di uno sviluppo X-Gal) è stato eseguito a 37 ° C .° C entro 1-6 ore.Gli embrioni sono stati post-fissati in PFA al 4% e visualizzati.
Per la macchia occidentale, le cellule sono state lisate in tampone di lisi passiva (Promega, Fitchburg, WI) integrata con una miscela di inibitori della proteasi Halt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).I lisati sono stati elaborati su gel già preparati TGX Mini-Protean TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) e trasferiti in poliacrilamide Mini-Protean (Bio-Rad, Hercules, CA) e trasferiti in membrane PVDF immobilita (EMD Millipore, Billerica, MA).Le membrane sono state bloccate in latte al 5% in PBS contenente lo 0,1% di due.Gli anticorpi sono stati incubati durante la notte a 4 ° C o per un'ora a temperatura ambiente.Il reagente ECL occidentale supersignale FEMTO (Thermo Scientific, Waltham, MA) è stato usato per la generazione del segnale.Per l'immunocolorazione, gli embrioni sono stati fissati durante la notte in PFA/PBS al 4% e crioconservati.Le criosezioni tissutali sono state bloccate in PBS contenenti siero di capra normale all'1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) e Triton X-100 allo 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e quindi incubate a 4 ° C in un incubatore durante il notte.con anticorpo secondario anti-anticorpo e fluorescente (1: 1000) per 1 ora a 4 ° C.Le sezioni colorate sono state collocate in medium d'oro prolungati (Thermo Scientific, Waltham MA) e le immagini piatte sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Leica TCS SPE.Ogni immunocolorazione è stata eseguita come tre esperimenti indipendenti su circoli di almeno due embrioni mutanti.Viene mostrato un esperimento rappresentativo.
Le cellule sono state incubate in tampone RIPA modificato (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% di glicerolo, 2 mM EDTA e inibitore della proteasi Halt (Sigma-Aldriche, St. Louis, MO) In breve, i lisati sono stati prepurizzati con perle magnetiche di proteina G (Life Technologies, Carlsbad, CA) e quindi incubati durante la notte a 4 ° C. con le perle di proteina proteina G di proteina G sono state utilizzate per estrarre Specc1L e il blotting occidentale è stato eseguito utilizzando l'antivita -β anticorpo-catenina descritto sopra gli esperimenti di co-IP mostrati sono rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti.
Le cellule in coltura fissa o i tessuti embrionali del topo sono stati forniti al centro di microscopia elettronica presso il Centro medico dell'Università del Kansas.In breve, i campioni sono stati incorporati in resina incorporata 812 (Sciences per microscopia elettronica, Fort Washington, Pennsylvania), polimerizzato durante la notte a 60 ° C e sezionati a 80 nm usando un ultramicrotoma Leica UC7 dotato di una lama di diamante.Le sezioni sono state visualizzate utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione JEOL JEM-1400 dotato di una pistola Lab6 da 100 kV.
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