Componente chimico del tubo a spirale in acciaio inossidabile 347, Identificazione di nuove proteine ​​chaperone dell'antigene leucocitario umano A (HLA-A) sensibili all'interferone mediante spettrometria di massa reticolata (CLMS)

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Descrizione del prodotto

Tubi a spirale in acciaio inossidabile 347L, grado di acciaio: SS347L

Il sistema di segnalazione dell’interferone induce una forte risposta citochinica a un’ampia gamma di segnali patogeni e patologici intrinseci provenienti dall’ambiente, con conseguente induzione di sottoinsiemi di proteine ​​inducibili dall’interferone.Abbiamo applicato la spettrometria di massa a collegamento incrociato mediata da DSS (CLMS) per rilevare nuove interazioni proteina-proteina nel dominio delle proteine ​​indotte dall'interferone.Oltre alle proteine ​​inducibili dall'interferone previste, abbiamo anche identificato nuovi addotti reticolati intermolecolari e intramolecolari di proteine ​​canoniche inducibili dall'interferone come MX1, USP18, OAS3 e STAT1.Ci siamo concentrati sulla validazione ortogonale di un nuovo set di reti proteiche inducibili dall'interferone formate da proteine ​​HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) utilizzando la co-immunoprecipitazione e sul loro ulteriore studio utilizzando la modellazione della dinamica molecolare.La modellizzazione della dinamica conformazionale del complesso proteico ha rivelato diversi siti di interazione che riflettevano le interazioni identificate nei risultati del CLMS.Insieme, presentiamo uno studio pilota sulla CLMS per identificare nuovi complessi di segnalazione indotti dall'interferone e attendiamo con ansia un uso più ampio della CLMS per identificare nuove dinamiche delle interazioni proteiche nel microambiente tumorale.
Prima che inizi una risposta immunitaria adattativa, il sistema di difesa innato dell'ospite attiva una risposta antimicrobica mediata da una famiglia di citochine alfa-elicoidali secrete chiamate interferoni (IFN).Le classi IFN di tipo I IFNα e IFNβ attivano le risposte cellulari, inclusi gli stati antivirale, proapoptotico, proinfiammatorio e antiproliferativo.Negli esseri umani sono noti 13 sottotipi di IFNα, tutti raggruppati sul cromosoma 91. Sorprendentemente, solo l'IFNα2 è stato studiato per uso clinico.Recentemente, particolare attenzione è stata rivolta alla ricerca su altri sottotipi di IFNα.Uno studio recente ha dimostrato che l’IFNα14 è una delle isoforme più efficaci nel limitare la replicazione di HBV2 e HIV-13,4 rispetto al sottotipo canonico IFNα2.
È stato stabilito che i complessi recettoriali dell'interferone di tipo I attivati ​​(IFNAR1 e IFNAR2) innescano una cascata di trasduzione del segnale mediata dalle Janus chinasi TYK2 e JAK15,6.Queste Janus chinasi fosforilano i trasduttori del segnale e gli attivatori delle proteine ​​trascrizionali (STAT1 e STAT2) sui residui di tirosina per avviare l'eterodimerizzazione mediata dal dominio SH26.Successivamente, IRF9 lega gli eterodimeri STAT per formare un complesso trimerico del gene del fattore 3 stimolato dall'IFN (ISGF3), che trasloca nel nucleo e induce la trascrizione di oltre 2000 geni stimolati dall'interferone (ISG)5,6,7,8.
Gli ISG costituiscono la spina dorsale del sistema immunitario innato, soprattutto in risposta all’attacco virale.Come prima linea di difesa contro l’infezione virale, le cellule sviluppano rapidamente estese interazioni delle proteine ​​cellulari con un’ampia gamma di attività biologiche.Queste proteine ​​includono recettori per il riconoscimento di pattern, molecole di segnalazione, fattori di trascrizione e proteine ​​con funzioni antivirali dirette, nonché regolatori negativi delle risposte immunitarie9.Gran parte delle informazioni sull'attività degli ISG provengono da screening funzionali che utilizzano screening di sovraespressione10,11 o tecniche di silenziamento genico (siRNA, RNAi e CRISPR)12,13 in cui i singoli ISG vengono espressi o inibiti e la loro attività viene testata su vari virus.Sebbene questi studi abbiano determinato le proprietà antivirali dei singoli ISG, i meccanismi molecolari sottostanti di ciascun ISG rimangono in gran parte sconosciuti.È generalmente accettato che molte proteine ​​interagiscono con una o più citochine per garantire la piena attività, quindi o gli ISG interagiscono direttamente oppure le loro interazioni sono mediate da proteine ​​cellulari.Ad esempio, un recente studio di proteomica fotoreticolata ha identificato l'ATPasi VCP/p97 come uno dei principali partner di interazione di IFITM3, la cui inibizione porta a difetti nello smistamento lisosomiale, nel turnover e nel cotrasporto di IFITM3 con particelle virali 14 .Utilizzando l'immunoprecipitazione, abbiamo identificato VAPA, una proteina associata alla vescicola, come partner di interazione con IFITM1/2/3 che media la maturazione virale mediata dal colesterolo, e ciò è stato confermato da un altro studio utilizzando un sistema a due ibridi di lievito.Supporto scientifico 15 , 16 .
Un processo biologico fondamentale coinvolto nella soppressione dell’infezione e della trasformazione maligna è la presentazione dell’antigene, che è mediata dalle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).I peptidi (lungi 8-12 aminoacidi) derivanti da proteine ​​scisse, terminate prematuramente o ripiegate in modo errato vengono caricati nell'eterodimero MHC-I (costituito da catene pesanti e leggere MHC-I, chiamate β-2-microglobulina; β2M) 17,18.I trimeri MHC-I stabili risultanti vengono trasportati sulla superficie cellulare, dove presentano peptidi intracellulari alle cellule T CD8+ (cellule T citotossiche)17.Le cellule T riconoscono e distruggono questi agenti patogeni e le cellule che trasportano un antigene tumore-specifico.Di conseguenza, gli agenti patogeni e le cellule tumorali spesso sopprimono il processo di presentazione dell’antigene per evitare la sorveglianza immunitaria.Inoltre, l'MHC-I è sottoregolato nel 40-90% dei tumori umani ed è spesso associato a una prognosi peggiore19.
I geni coinvolti nella risposta agli agenti patogeni devono passare rapidamente da uno stato di riposo a uno stato di trascrizione attiva.Pertanto, si ipotizza che diverse proteine ​​cellulari siano coinvolte nella risposta all'elevata domanda di IFN in brevi periodi di tempo, compreso il rimodellamento e la modificazione del promotore della cromatina 20,21.La maggior parte degli studi si sono concentrati sull'identificazione dei singoli partner proteici ISG in presenza di IFN.Diversi studi di proteomica e trascrittomica in sistemi cellulari modello hanno chiarito l'effetto dell'IFN sul paesaggio cellulare.Tuttavia, nonostante una crescente comprensione delle dinamiche indotte dagli interferoni, sappiamo ancora poco sul coinvolgimento degli ISG.Quando si considera la complessità e la dinamica dipendente dal tempo della segnalazione dell’interferone, sorgono due domande: (i) è possibile stabilizzare e intrappolare i complessi multiproteici coinvolti nella segnalazione rapida e (ii) è possibile mappare queste interazioni nello spazio 3D?
Per affrontare questi problemi, abbiamo implementato il cross-linking chimico mediato da disuccinimide (DSS) accoppiato con la spettrometria di massa (CLMS) per studiare la rete di interazione proteica indotta da IFNα e le sue dinamiche.Il DSS aggiunge legami covalenti tra residui prossimali di proteine ​​e/o complessi proteici in vivo.La successiva analisi MS rivela specifici siti di reticolazione che riflettono la vicinanza spaziale di regioni all'interno di una particolare proteina, chiamati collegamenti interni, o subunità in complessi proteici, chiamati interrelazioni.Utilizzando questo approccio, abbiamo identificato diversi nuovi complessi proteina-proteina nonché reti di interazione multiproteica indotte dall'interferone.Testando ulteriormente un sottoinsieme di queste nuove interazioni, dimostriamo che H2BFS (FS di tipo istone H2B; di seguito denominato H2B) e MDN1 agiscono come partner leganti per HLA-A.
Le cellule Flo-1 sono uno dei modelli in vitro più conosciuti di adenocarcinoma esofageo poiché imitano le caratteristiche chiave dei tumori esofagei22,23.Tuttavia, non tutti i tumori sono immunogenici e per determinare se le cellule Flo-1 rispondono al trattamento con interferone, abbiamo trattato le cellule Flo-1 con 10 ng/ml di IFNα per 72 ore.Le cellule Flo-1 hanno mostrato un'induzione precoce di pSTAT1 e IRF1, iniziando 2 ore dopo il trattamento e continuando per 72 ore, con una diminuzione dipendente dal tempo dei livelli stazionari di IRF1 (Figura 1A).Gli ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 e ISG15) sono risultati fortemente indotti dopo 6 ore, imitando le classiche risposte di fase media e tardiva all'IFNα (Figura 1A).Insieme, questi dati suggeriscono che questo modello cellulare può essere utilizzato per studiare le risposte dell'interferone.
Risposte differenziali di espressione proteica nelle cellule Flo-1 dopo il trattamento con IFNα.(A) L'espressione proteica nelle cellule Flo-1 trattate con 10 ng/ml IFNα per 2, 6, 24, 48 e 72 ore è stata analizzata mediante immunoblot utilizzando gli anticorpi ISG indicati.(B) Gel SDS-PAGE colorati con blu Coomassie di estratti di cellule intere dopo la reticolazione con DSS per i tempi e le concentrazioni indicati.(C) Immunoblot rappresentativo esaminato con anticorpo p53(DO-1) dagli stessi campioni per valutare il grado di reticolazione proteica.
Per catturare il panorama dell'interazione proteica in situ, abbiamo utilizzato il DSS, un agente reticolante ampiamente utilizzato grazie alla sua elevata permeabilità della membrana e al tempo di reazione relativamente breve.Il tempo di reazione più breve aiuta a prevenire la formazione di grandi aggregati di proteine ​​reticolate, mantenendo così la stabilità del reticolante.Per determinare la concentrazione DSS ottimale ed evitare una reticolazione eccessiva, abbiamo prima esposto le cellule a 5, 2,5 e 1 mM DSS per 5, 10, 5 e 30 minuti, rispettivamente, e analizzato i lisati mediante SDS-PAGE colorata con Coomassie (dati non mostrati) .I lisati cellulari sembrano essere altamente reticolati alla concentrazione più bassa e nel momento più breve.Pertanto, il DSS è stato titolato a 1, 0,5 e 0,1 mM in 5 minuti (Figura 1B).È stata osservata una reticolazione ottimale con DSS 0,5 mM per 5 minuti e queste condizioni sono state scelte per le cellule trattate con IFNα.Inoltre, la Figura 1C mostra un Western blot eseguito utilizzando l'anticorpo p53 (DO-1) per valutare il grado di reticolazione proteica.
Le cellule Flo-1 sono state trattate con 10 ng/ml di IFNα per 24 ore prima di aggiungere il reticolante.Le cellule reticolate sono state successivamente lisate mediante proteolisi in due fasi e le proteine ​​sono state processate mediante FASP (Fig. 2)24,25.I peptidi triptici reticolati sono stati analizzati mediante spettrometria di massa (Fig. 2).Gli spettri MS/MS vengono quindi abbinati alla sequenza proteica e quantificati con MaxQuant26,27.I peptidi reticolati sono stati identificati dagli spettri ottenuti utilizzando il programma SIM-XL e i singoli composti sono stati combinati in una rete complessa utilizzando le pipeline software di calcolo open source xQuest28 e SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifica le interazioni proteina-proteina, le catene interne e le singole catene in miscele proteiche semplici o complesse e fornisce script per visualizzare le interazioni nelle strutture proteiche.Inoltre, classifica ciascun riferimento incrociato come un punteggio ID in base alla qualità dello spettro MS/MS29.Sono stati identificati diversi complessi e interazioni proteina-proteina altamente affidabili e una nuova serie di interazioni è stata ulteriormente studiata utilizzando la co-immunoprecipitazione e i cambiamenti conformazionali dei complessi utilizzando la modellazione della dinamica molecolare (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Panoramica schematica del metodo CLMS.Le cellule Flo-1 sono state trattate con 10 ng/ml IFNα per 24 ore seguite da reticolazione proteica in situ utilizzando DSS seguita da lisi cellulare e trypsinizzazione.I campioni reticolati sono stati analizzati utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap e ulteriormente campionati per la frammentazione dei precursori peptidici durante LC-MS/MS.Due peptidi collegati sono stati identificati dagli spettri ottenuti utilizzando il programma Spectrum Recognition Machine del Crosslinked Peptides (SIM-XL) e tutti i composti sono stati combinati in una rete complessa utilizzando pipeline computazionali.Filtra le interazioni a bassa confidenza in base ai punteggi del tasso di falsi positivi (FDR).Diverse nuove interazioni proteina-proteina ad alta fedeltà sono state ulteriormente confermate utilizzando la co-immunoprecipitazione e i cambiamenti conformazionali nei complessi sono stati esaminati utilizzando la modellazione della dinamica molecolare (MD).
Un totale di ~ 30.500 e ~ 28.500 peptidi sono stati rilevati utilizzando MaxQuant rispettivamente in campioni IFNα non stimolati e stimolati (Tabella supplementare S1, Fig. 3A).La distribuzione della lunghezza del peptide in entrambi i casi ha mostrato una percentuale maggiore di peptidi più grandi, indicando la presenza di peptidi reticolati (Fig. 3B,C).Inoltre, una percentuale maggiore di peptidi più grandi era presente nell'intervallo 40-55 nei campioni trattati con IFNα (Fig. 3C).La mappatura delle proteine ​​rispetto all'intensità log2 ha mostrato che le proteine ​​classiche stimolate dall'interferone erano le più abbondanti rispetto ai campioni non trattati, inclusi MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 e HLA-F (Figura 3D).L'analisi dei percorsi delle proteine ​​arricchite più di tre volte in risposta al trattamento con IFNα utilizzando il database dei percorsi Reactome ha mostrato che la presentazione e l'elaborazione dell'antigene mediata da MHC-I era la via più dominante (Figura 3E).Coerentemente con i rapporti precedenti, le risposte antivirali mediate da OAS e ISG15 così come IFNα/β e la segnalazione delle citochine erano tra i percorsi attivati.Inoltre, i legami incrociati proteici specifici della lisina e della serina sono stati identificati dagli spettri MS/MS originariamente acquisiti utilizzando SIM-XL.Uno studio recente ha riportato 104 ISG che coprono 20 virus da 9 classi di virus mediante meta-analisi di studi individuali di sovraespressione di ISG in 5 tipi di cellule9.Tuttavia, per superare i limiti computazionali dello screening di set di dati di grandi dimensioni, abbiamo iniziato con un set di dati più piccolo per esplorare le possibili interazioni tra l'elenco dei geni IRDS riportati da Padaria et al., la maggior parte dei quali sono ISG.
Identificazione di proteine ​​reticolate espresse in modo differenziale in risposta all'IFNα (dati ottenuti da MaxQuant).(A) Diagramma di Venn che rappresenta il numero di peptidi comuni ed esclusivi identificati nei campioni Flo-1 trattati con IFNα14 e non trattati.Distribuzione della lunghezza del peptide di campioni reticolati non trattati (B) e trattati con IFNα (C).(D) Mappa termica che rappresenta log2 (intensità LFQ) tra cellule Flo-1 non trattate e trattate con IFNα14.Il pannello di sinistra mostra le proteine ​​attivate più attivamente in presenza di IFNα.(E) Istogramma che rappresenta i 20 principali percorsi di arricchimento dopo il trattamento con IFNα.Il database del percorso Reactome ha analizzato cambiamenti più di quattro volte nelle proteine ​​sovraregolate che rispondono all’IFNα.
La stimolazione dell’ISG mediata dall’interferone è ben documentata, ma a livello molecolare non è chiaro come queste proteine ​​culminino in un’ampia gamma di funzioni biologiche.Abbiamo studiato le interazioni proteiche con un alto grado di confidenza tra ISG noti.È interessante notare che abbiamo identificato una rete che include proteine ​​MX1, USP18, ROBO1, OAS3 e STAT1 che formano un grande complesso in risposta al trattamento con IFNα (Figura 4, Tabella S2) 32,33,34.Ancora più importante, queste interazioni sono state trovate in tutti i triplicati trattati con IFNα e non sono state trovate nei campioni non trattati, suggerendo che si sono formate specificamente in risposta al trattamento con IFNα.È noto che STAT1 regola trascrizionalmente l'espressione di questi ISG, ma la sua interazione con gli ISG a livello proteico non è stata studiata.La struttura cristallina di STAT1 ha mostrato che il suo dominio elicoidale (CCD) non è coinvolto nell'interazione con il DNA o con i protomeri durante la formazione dei dimeri35.Queste α-eliche formano una struttura ad elica elicoidale che fornisce un'area superficiale prevalentemente idrofila affinché possano verificarsi le interazioni 35 .Nei nostri dati CLMS, abbiamo osservato che la maggior parte delle interazioni con STAT1 si è verificata nel dominio SH2 che precede il CCD, il dominio del linker o la coda C-terminale (residui 700-708) (Figura 4A).Uno studio precedente ha riportato che USP18 si lega al CCD e al dominio di legame del DNA (DBD) di STAT2 e viene reclutato nella subunità del recettore dell'interferone di tipo I IFNAR2 per mediare l'inibizione della segnalazione dell'interferone di tipo I24.I nostri dati hanno anche mostrato che il dominio catalitico USP18 interagisce con STAT1 DBD (Figura 4A,D), suggerendo che sia STAT1 che STAT2 possono svolgere un ruolo nell'attrarre USP18 a IFNAR2.
Rete ISG proteina-proteina identificata in cellule reticolate trattate con IFNα.(A) Grafico delle interazioni 2D che mostra le interazioni proteina-proteina (generato nel programma SIM-XL), con linee che rappresentano le interazioni intermolecolari (taglio del collegamento incrociato impostato su 3,5).Domini di identità diverse sono contrassegnati dal loro colore32: dominio MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) e GED (569–660).Domini OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) e OAS1_C (903-108).Dominio ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) e fn3 (777–864).Campi STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) e STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Visualizzatore circolare di proteine ​​reticolate (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 e STAT1) con interazioni e interazioni etichettate rispettivamente in blu e rosso.La soglia di reticolazione è stata fissata a 3,5.I grafici a punti indicano i siti di interazione STAT1 con MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) e OAS3 (F), nonché i siti di interazione K o S tra i due peptidi.Nella figura, la soglia del punteggio di cross-link è impostata su 3,0.(G) Vari siti di interazione tra i domini DI STAT1 e OAS3 sovrapposti alle loro strutture proteiche in PyMol (sistema di grafica molecolare PyMOL, versione 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (ID pdb: 1bf533) e OAS3 (ID pdb: 4s3n34).) programma.
Nell'uomo sono state descritte due isoforme di USP18, una proteina a lunghezza intera localizzata prevalentemente nel nucleo e un'isoforma senza dominio N-terminale, USP18-sf, distribuita uniformemente nel citoplasma e nel nucleo36.Inoltre, si prevedeva che l'N-terminale non fosse strutturato e non richiedesse attività di isopeptidasi o legame ISG1537.La maggior parte delle interazioni identificate nel nostro studio erano situate all'N-terminale della proteina, suggerendo che queste interazioni coinvolgono USP18 a lunghezza intera (Figura 4A,D) e quindi probabilmente si verificano nel nucleo.Inoltre, i nostri dati indicano anche che l'N-terminale è specializzato per le interazioni proteina-proteina.Il sito di legame dell'IFNAR2 è situato tra i residui 312-368 e, in particolare, nessuna delle proteine ​​del complesso si lega a questa regione (Fig. 4A) 37,38.Questi dati presi insieme indicano che il dominio di legame IFNAR2 è utilizzato esclusivamente dalla proteina recettore.Inoltre, solo OAS3 e ROBO1 sono risultati associati a domini a monte del sito di legame N-terminale e IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 appartiene alla superfamiglia delle immunoglobuline (Ig) delle molecole di segnalazione transmembrana ed è costituito da cinque domini Ig e tre domini fibronectina (Fn) nella regione extracellulare.Questi domini extracellulari sono seguiti da una regione prossimale della membrana e da una singola elica transmembrana 39. Una regione intracellulare non strutturata è situata al C-terminale e contiene motivi di sequenza conservati che mediano il legame delle proteine ​​effettrici39.La regione che si estende dagli amminoacidi ~1100-1600 è per lo più disordinata.Abbiamo scoperto che MX1 interagisce con ROBO1 attraverso Ig, Fn e domini intracellulari, mentre la maggior parte delle interazioni con STAT1 avviene tra il suo CCD, il dominio linker e il C-terminale di ROBO1 (Fig. 4A,E).D'altra parte, le interazioni con le regioni linker DI, DIII e OAS3 erano distribuite in tutta la proteina ROBO1 (Fig. 4A).
La famiglia di proteine ​​dell'oligoadenilato sintasi (OAS) accetta e lega l'RNA intracellulare a doppio filamento (dsRNA), subisce cambiamenti conformazionali e sintetizza oligoadenilati legati con legami 2′,5′ (2-5 As) 40 .Si è scoperto che tra i tre OAS, OAS3 mostra la massima affinità per il dsRNA e sintetizza la quantità minima di 2-5 As, che possono attivare la RNasi L e quindi limitare la replicazione virale 41 .La famiglia OAS è costituita da domini nucleotidici transferasi simili alla polimerasi beta (pol-β).Precedenti ricerche hanno dimostrato che l'attività catalitica del dominio C-terminale (DIII) dipende dal dominio di legame del dsRNA (DI), necessario per l'attivazione di OAS342.Abbiamo osservato che i domini DI e DII di OAS3 interagiscono con CCD e una piccola regione di giunzione tra SH2 e STAT1 TAD (Figura 4A,F).La sovrapposizione di diversi siti di reticolazione sulla struttura proteica ha rivelato un'interazione tra il foglio β e l'anello DBD STAT1 e una tasca aperta o cavità formata dai residui 60-75 nel dominio DI di OAS3 (Fig. 4G).L'orientamento delle proteine ​​nel complesso indicava anche che nessuna delle interazioni con OAS3 interferiva con la capacità di legame del DNA del suo dominio DI (Fig. S1A).Inoltre, il dominio N-terminale di GTPasi MX1 interagisce ampiamente con i domini DI e DIII di OAS3 (Fig. 4A).Abbiamo anche osservato un'interazione tra OAS1 e MX1 in tutte e tre le ripetizioni trattate con IFNα, dove un singolo dominio OAS1 (anche cataliticamente attivo) ha interagito con tutti e tre i domini MX1 (Figura S2A,B).
Le proteine ​​MX fanno parte di una vasta famiglia di GTPasi dineina-simili che contengono un dominio GTPasi N-terminale che lega e idrolizza GTP, un dominio intermedio che media l'autoassemblaggio e una cerniera di leucina C-terminale che agisce come una GTPasi (LZ ).dominio effettore dominio25,43.MX1 si lega alle subunità delle polimerasi virali per bloccare la trascrizione del gene virale43.Uno screening di due ibridi di lievito precedentemente riportato ha mostrato che MX1 associato a PIAS1 inibisce l'attivazione del gene mediata da STAT1 bloccando l'attività di legame del DNA e ha anche attività di ligasi SUMO E344,45.Qui, dimostriamo che MX1 si lega a STAT1 (Figura 4C,D), tuttavia il modo in cui questa interazione influisce sull'attivazione del gene mediata da STAT1 in risposta all'IFNα necessita di ulteriori studi.Inoltre, abbiamo anche scoperto che MX1 interagiva con IFIT3 e DDX60 in tutte e tre le ripetizioni trattate con IFNα (Fig. S2C).
DDX60 è un'elicasi citoplasmatica indotta da IFN che è stata precedentemente segnalata per svolgere un ruolo nella degradazione indipendente da RIG-I dell'RNA virale46.Interagisce con RIG-I e attiva la sua segnalazione in modo specifico del ligando 46. DDX60 è costituito da un dominio elicasi DEXD/H-Box e un dominio elicasi C-terminale che legano l'RNA virale e il DNA47.La maggior parte delle sue interazioni con MX1 e IFIT3 si verificano all'interno di lunghe regioni N e C-terminali senza domini o motivi canonici (Fig. S2E, F).Tuttavia, MX1 è anche associato al dominio elicasi DEXD/H-Box (Fig. S2E).Le proteine ​​della famiglia IFIT hanno copie tandem di un caratteristico motivo elica-giro-elica chiamato ripetizione del tetrapeptide (TPR).Si è scoperto che IFIT3 è un modulatore positivo della segnalazione RIG-I e quindi un componente del complesso MAVS.Presi insieme, i nostri dati suggeriscono che IFIT3 e DDX60 interagiscono principalmente nella regione tra TPR 3–6 di IFIT3 e possono svolgere un ruolo nella segnalazione RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Dato che lo screening dell'intero proteoma è impegnativo dal punto di vista computazionale, abbiamo quindi analizzato l'intero database UniProt umano per la presenza di una delle ripetizioni trattate con IFNα.In questa replica abbiamo trovato diverse reti di interazione altamente affidabili per HLA-A.L'analisi delle vie proteiche identificate dagli spettri MS/MS ha mostrato che l'elaborazione e la presentazione dell'antigene basata su MHC-I è la via principale indotta dall'interferone (Fig. 3D).Pertanto, ci siamo concentrati sullo studio delle interazioni proteiche delle molecole MHC-I con un alto grado di confidenza in tutti i campioni reticolati.L'HLA è costituito da domini α1, α2 e α3 e da catene leggere, mentre la microglobulina β2 (β2m) è una proteina chaperone costante49.Una volta assemblato nel reticolo endoplasmatico, l'HLA è instabile in assenza di ligandi peptidici50.Il solco di legame del peptide è formato dai domini α1 e α2 altamente polimorfici e non strutturati in forma non peptidica e dal dominio α351 relativamente meno polimorfico.In presenza di IFNα, abbiamo rilevato due complessi HLA-A: uno interagisce con HMGA1 e H2B (Figura 5, Tabella S3) e l'altro interagisce con MDN1, LRCH4 e H2B (Figura 6).
IFNα induce una rete di interazione HLA-A con H2B (H2BFS) e HMGA1.(A) Grafico 2D (generato nel software SIM-XL) raffigurante diversi tipi di interazioni nel complesso H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (blu), interlink (rosso) e collegamento singolo (nero)..Domini di diversa identità sono codificati a colori32: H2B (istone; 2–102) e MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364).La soglia di reticolazione è stata fissata a 3,5.I grafici a punti indicano i siti di interazione HLA-A con H2B (B) e HMGA1 (C), nonché i siti di interazione K o S tra i due peptidi.Nella figura, la soglia del punteggio di cross-link è impostata su 3,0.(D) Relazioni tra le proteine ​​mostrate nelle strutture delle proteine ​​H2B, HLA-A e HMGA1 nel programma PyMOL.Queste strutture sono state modellate utilizzando il server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) e le strutture modello per le proteine ​​H2B, HLA-A e HMGA1 erano rispettivamente 1kx552, 1kj349 e 2eze55.
IFNα induce una rete di interazione HLA-A con H2B (H2BFS), MDN1 e LRCH4.(A) Collegamenti incrociati intramolecolari (rossi) e intermolecolari (blu) presentati su una mappa interattiva 2D (generata nel software SIM-XL) con MDN1 rappresentato come un cerchio.La soglia di reticolazione è stata fissata a 3,5.Domini di identità diverse sono codificati a colori32: H2B (istone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364) e LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) e CH (535–641)).(B) Relazioni tra le proteine ​​mostrate nelle strutture delle proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1 nel programma PyMOL.Queste strutture sono state modellate utilizzando il server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) con strutture modello 1kx552, 1kj349, 6hlu62 e 6i2665 per le proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1, rispettivamente.Diagrammi a punti che mostrano i siti di interazione K o S per HLA-A con H2B (C), LRCH4 (D) e MDN1 (E).Per i grafici, la soglia del punteggio di cross-link è stata impostata su 3,0.
Oltre a mantenere l'integrità del genoma, l'istone H2B è coinvolto anche nella regolazione della trascrizione.La proteina H2B è costituita da un dominio istonico centrale (HFD) formato da tre α-eliche separate da anse e una coda C-terminale 41,52.La maggior parte dell'interazione con H2B avviene nell'elica α1, che fornisce la trimerizzazione con l'eterodimero HFD (Fig. 5A,B).Sebbene le lisine siano coinvolte nel legame del DNA, alcune lisine sono anche siti alternativi di acetilazione o metilazione.Ad esempio, i residui K43, K46 e K57 dell'H2B non sono coinvolti nel legame diretto al DNA, ma sono target di varie modificazioni post-trascrizionali53.Allo stesso modo, i residui K44, K47 e K57 in H2B possono svolgere un ruolo alternativo in presenza di IFNα, comprese le interazioni con altre proteine ​​(Fig. 5A, B).Inoltre, l'istone extracromosomico H2B attiva la risposta immunitaria in vari tipi di cellule, agendo come un sensore citosolico per rilevare frammenti di DNA a doppio filamento (dsDNA) derivati ​​da agenti infettivi o cellule danneggiate54.In presenza di virus a DNA, la deplezione di H2B ha inibito la produzione di IFN-β e la fosforilazione di STAT154.È noto anche che l'H2B entra ed esce dal nucleo più velocemente degli altri istoni centrali54.In campioni selezionati non trattati sono state osservate anche interazioni H2B con MDN1 e LRCH4.Abbiamo scoperto che HLA-A interagiva con H2B in tutti e tre i campioni trattati con IFNα e in un campione ripetuto non trattato.Questi dati riflettono il ruolo di H2B in una funzione fisiologica alternativa indipendente dalla regolazione trascrizionale.
HMGA1 (gruppo ad alta mobilità AT-Hook 1), una piccola nucleoproteina ricca di aminoacidi che promuovono la malattia, è stata identificata in associazione con HLA-A.Ha una coda C-terminale acida e tre DBD distinti chiamati ganci AT perché si legano al solco minore della regione ricca di AT nel dsDNA55,56.Questo legame fa piegare o raddrizzare il DNA, consentendo ai fattori di trascrizione canonici di accedere alla sua sequenza consenso.Si ritiene che la coda C-terminale sia coinvolta nelle interazioni proteina-proteina e nel reclutamento di fattori di trascrizione, poiché i mutanti di delezione C-terminale non sono in grado di avviare la trascrizione57.Inoltre, questo dominio contiene diversi siti di fosforilazione conservati che sono noti substrati per le chinasi 58 .Abbiamo osservato interazioni HLA-A e H2B con HMGA1 al di fuori del dominio C-terminale, suggerendo che il dominio C-terminale è utilizzato principalmente per il legame del fattore di trascrizione (Fig. 5A, C).Le proteine ​​HMGA competono con l'istone H1 per il legame al DNA adattatore, aumentando così l'accessibilità57.Allo stesso modo, sembra probabile che HMGA interagisca con l'istone H2B lungo il DNA del linker in competizione con l'istone H1.HMGB1 induce l'espressione di HLA-A, -B e -C nelle cellule dendritiche, portando alla loro attivazione59, ma non è stata precedentemente segnalata un'interazione tra HMG e HLA.Abbiamo scoperto che HMGA1 interagisce con i domini α1 e α3 di HLA-A, con la maggior parte delle interazioni al di fuori dei suoi 3 DBD (Figura 5A,C).Nelle nostre mani, si è scoperto che HLA-A è localizzato nel nucleo (dati non mostrati) e dato che anche H2B e HMGA1 sono presenti nel nucleo, questa interazione probabilmente avviene nel nucleo.Gli addotti specifici misurati tra H2B, HLA-A e HMGA1 sono mostrati nella Figura 5D.
La maggior parte delle interazioni di HLA-A con altre proteine ​​si verificano all'interno dei suoi domini α1 e α2 e nel dominio C-terminale disordinato (Fig. 6).In uno di questi esempi, abbiamo scoperto che HLA-A interagisce con la coda N-terminale disordinata di LRCH4 (Figura 6A,D).LRCH4 regola l'attivazione di TLR4 e l'induzione di citochine LPS, modulando così la risposta immunitaria innata60,61.È una proteina di membrana con nove ripetizioni ricche di leucina (LRR) e un motivo di omologia con calmodulina (CH) nel suo ectodominio, seguito da un dominio transmembrana (TMD) 60, 62.È stato riportato che i domini CH mediano le interazioni proteina-proteina60.Un tratto di circa 300 aminoacidi tra i domini LRR e CH è relativamente accessibile ma disordinato.Basandoci sulla funzione delle regioni disordinate come mediatori delle reti proteina-proteina e del trasporto vescicolare 63, abbiamo scoperto che la maggior parte delle interazioni proteiche si verificano nelle regioni disordinate.Le interazioni con MDN1 erano distribuite su tutta la lunghezza della proteina, inclusi i domini LRR1, LRR6, CH e regioni casuali, mentre H2B si legava principalmente al dominio CH (Fig. 6A, B).In particolare, nessuna delle interazioni includeva l'ATM, suggerendo la specificità dell'approccio CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 è stato identificato anche come parte della rete proteica HLA-A (Figura 6A).Appartiene alla famiglia delle proteine ​​AAA (ATPasi associate a diverse attività).Questo è lo stesso dominio AAA N-terminale che si organizza in un anello esamerica e rimuove il fattore di assemblaggio dalla subunità ribosomiale 60S 64.sembra essere simile alla dineina64,65,66.Inoltre, la regione ricca di Asp/Glu è seguita dal dominio MIDAS (sito dipendente dagli ioni metallici).A causa delle grandi dimensioni di MDN1 (circa 5600 aminoacidi) e della sua limitata omologia con proteine ​​ben studiate, si sa poco sulla sua struttura e funzione nell'uomo.Abbiamo identificato HLA-A, H2B e LRCH4 come partner di legame MDN1 e abbiamo rivelato il loro orientamento come complessi proteici in PyMol (Fig. 6A, B).Queste tre proteine ​​interagiscono con il dominio AAA, il dominio linker simile alla dineina e possibilmente il dominio MIDAS MDN1.In un precedente rapporto, la purificazione per affinità delle proteine ​​esca ha identificato MDN1 come una proteina associata all'istone H2B67.Inoltre, uno studio recente ha riportato anche un'interazione tra MDN e HLA-B nelle cellule HCT116 utilizzando la spettrometria di massa purificata per affinità, supportando i nostri risultati68.L'identificazione di questo complesso nei campioni trattati con IFNα suggerisce un ruolo di MDN1 nella segnalazione dell'interferone.
Poiché i geni HLA sono altamente polimorfici, abbiamo estratto le letture di sequenziamento che mappano HLA-A, -B e -C dai dati di sequenziamento dell'RNA delle cellule Flo-1 (dati non mostrati).Le sequenze peptidiche coerenti con la lettura del sequenziamento hanno rivelato differenze significative tra HLA-A, -B e -C nelle regioni in cui i peptidi reticolati erano localizzati in HLA-A (Figura S3).Inoltre, non abbiamo osservato la reticolazione proteina-proteina delle molecole HLA-B/C con le proteine ​​H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Ciò suggerisce che l'interazione proteica riscontrata tra HLA-A, MDN1, LRCH1 e HMGA1 è specifica per HLA-A.Inoltre, l'analisi proteomica dei campioni non reticolati (Tabella S4) ha mostrato che l'HLA-A ha una copertura di sequenza maggiore rispetto a HLA-B o HLA-C.I peptidi identificati per HLA-A erano di intensità elevata sia nei campioni trattati con IFNα che in quelli non trattati.
Per garantire che le interazioni qui identificate non fossero dovute alla reticolazione non specifica di due proteine ​​in stretta prossimità spaziale, abbiamo ulteriormente confermato due nuovi fattori interagenti HLA-A eseguendo test di co-immunoprecipitazione.Interazioni HLA-A con MDN1 e H2B endogeni sono state rilevate sia nelle cellule Flo-1 trattate con IFNα che non trattate (Figura 7, Figura S4).Abbiamo confermato che l'HLA-A è stato catturato dall'H2B negli immunoprecipitati e che questa associazione era dovuta al trattamento con IFNα poiché l'HLA-A era assente nei campioni di immunoprecipitati provenienti da cellule non trattate (Figura 7A).Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che IFNα regola in modo differenziale il legame HLA-A con H2B e MDN1.IFNα induce l'associazione tra H2B e HLA-A, ma riduce la sua associazione con MDN1.Abbiamo scoperto che MDN1 era associato a HLA-A nei controlli e l'aggiunta di IFNα riduceva questa interazione indipendentemente dall'induzione di MDN1 da parte di IFNα (Figura 7B,C).Inoltre, l'immunoprecipitazione HLA-A ha catturato H2B nelle cellule A549 (Fig. S4), suggerendo che questa interazione è indipendente dal tipo di cellula.Presi insieme, questi risultati supportano le interazioni mediate dall'interferone di HLA-A con H2B e MDN1.
HLA-A co-purifica H2B e MDN1.Gli immunoblot endogeni rappresentativi H2B (A) e MDN1 (B) sono stati immunoprecipitati da cellule Flo-1 trattate con IFNα e analizzati per gli anticorpi indicati.Come controllo negativo sono state utilizzate IgG di topo e coniglio.(C) Quantità relative (input) di diversi antigeni sono rappresentate da immunoblot analizzati contro gli anticorpi indicati, la β-actina è stata utilizzata come controllo di caricamento.
Sono state studiate le proprietà strutturali di una delle reti reticolate altamente affidabili indotte dall'interferone, H2B-HLA-A-HMGA1.Abbiamo utilizzato la modellazione della dinamica molecolare come approccio alternativo per comprendere la dinamica conformazionale delle proteine ​​coinvolte in questo complesso (Figura 8).Le deduzioni dai dati CLMS suggeriscono la possibilità di diverse conformazioni delle proteine ​​H2B, HLA-A e HMGA1.Pertanto, i seguenti potenziali complessi sono stati modellati in un mezzo solvente: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.Una schermata iniziale di docking proteina-proteina utilizzando il pacchetto MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ha suggerito possibili conformazioni che differiscono tra queste proteine ​​(Fig. 8A).La visualizzazione del complesso proteico di aggancio ha rivelato diverse interazioni e possibili conformazioni (Figura 5A, 8).Pertanto, una possibile conformazione è mostrata nella Figura 8A (con collegamenti incrociati etichettati) ed è stata ulteriormente valutata utilizzando la pipeline di modellazione MD.Inoltre, il legame di H2B o HMGA1 a HLA-A evidenzia la maggiore affinità di H2B per HLA-A (Fig. 8A).
Dinamica conformazionale di possibili reti tra i complessi H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Il pannello di sinistra è una mappa 2D (generata nel software SIM-XL) di collegamenti incrociati intramolecolari (rosso) e intermolecolari (blu) (taglio del collegamento incrociato impostato su 3,5).Inoltre, i residui di reticolazione identificati sono marcati sulle strutture delle proteine ​​H2B, HLA-A e HMGA1.Le conformazioni associate di queste proteine ​​sono state estratte utilizzando la pipeline di docking implementata nel pacchetto MOE.Il pannello in basso a sinistra mostra le varie possibili conformazioni dei complessi H2B-HLA-A e HMGA1-HLA-A con diverse affinità di legame proteina-proteina (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Deviazione standard (RMSD) delle posizioni atomiche (esclusi gli atomi di idrogeno) per ciascuna struttura proteica.(C) Interazioni di legami idrogeno intermolecolari proteina-proteina da vari complessi simulati considerando interazioni specifiche di durata ≥ 10 ns.La distanza di cutoff donatore-accettore del legame H è stata impostata su 3,5 Å e l'angolo di cutoff donatore-accettore H è stato impostato su ≥ 160°-180°.(D) Residui marcati che formano interazioni proteina-proteina HLA-A con i rispettivi partner, che si estendono su ≥ 20 ns, estratti da complessi fittizi HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1.Le strutture proteiche rappresentano una struttura media di MDS da 100 ns.(E) Interazioni tra i complessi HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1 rispetto alle interazioni tracciate dalla simulazione H2B-HLA su 100 ns in base al sito di interazione K o S tra i due peptidi.Complessi /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Il valore soglia per la valutazione dei legami crociati è stato fissato a 3,0 e sono state prese in considerazione le interazioni specifiche da MDS che richiedono ≥ 10 ns.Le strutture proteiche sono state visualizzate utilizzando i pacchetti BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) e Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
La stabilità delle molecole HLA-A nel tempo (deviazione standard; RMSD o deviazione standard; RMSF) ha indicato che la presenza di proteine ​​H2B o HMGA1 nei complessi ha stabilizzato HLA-A (Figura 8B, Figura S5).La proteina HMGA1 si lega strettamente al sito B2M di HLA-A, inducendo la stabilità degli aminoacidi HLA-A nel complesso HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).in particolare, i residui HLA ~60-90 e ~180-210 sono risultati meno flessibili in presenza di H2B (FIG. 8B).H2B e HMGA1 hanno mostrato un migliore legame con HLA-A nel complesso H2B-HLA-A-HMGA1 rispetto al legame HLA-A con H2B o HMGA1 da solo (Figura 8C,D; Tabella S5).I residui coinvolti nel legame idrogeno (MD modellato ad alta occupazione ≥ 10 ns) coincidono con i siti di interazione CLMS (residui K o S) nel complesso, suggerendo che le interazioni identificate da CLMS sono molto affidabili.Affidabilità (Fig. 8E).Nella modellazione CLMS e MD, è stato scoperto che residui HLA-A tra circa 190-210 e circa 200-220 amminoacidi si legano rispettivamente a H2B e HMGA1 (FIG. 8E).
Le interazioni proteina-proteina formano reti strutturali dinamiche che mediano la comunicazione intracellulare in risposta a determinati stimoli.Poiché molti approcci proteomici rilevano cambiamenti nel livello complessivo dello stato stazionario di una proteina, le dinamiche di interazione proteina-proteina richiedono strumenti aggiuntivi per catturare le interfacce di legame e CLMS è uno di questi strumenti.Il sistema di segnalazione dell’interferone è una rete di citochine che consente alle cellule di rispondere a una serie di segnali patogeni ambientali e patologici intrinseci, culminando nell’induzione di sottoinsiemi di proteine ​​inducibili dall’interferone.Abbiamo applicato CLMS per determinare se nuove interazioni proteina-proteina potessero essere identificate tra un pannello di proteine ​​indotte dall'interferone.Per catturare i complessi proteici è stata utilizzata l'analisi globale della reticolazione proteica in un modello cellulare Flo-1 sensibile all'interferone.L'estrazione di peptidi triptici da cellule reticolate e non reticolate consente il conteggio dei peptidi, l'arricchimento del percorso e la distribuzione della lunghezza del peptide con intensità LFQ definita.Le proteine ​​canoniche inducibili dall'interferone sono state identificate come controllo interno positivo, mentre sono stati osservati nuovi addotti intermolecolari e intramolecolari reticolati di proteine ​​canoniche inducibili dall'interferone come MX1, UP18, OAS3 e STAT1.Sono state studiate varie caratteristiche strutturali e interazioni nelle aree funzionali.
Un'interazione tra HLA-A, MDN1 e H2B è stata rilevata mediante immunoblotting nelle cellule Flo-1 e A549 trattate e non trattate con IFNα.I nostri risultati evidenziano che HLA-A si complessa con H2B in modo IFNα-dipendente.Il nostro lavoro rappresenta una strada interessante per ulteriori esplorazioni della co-localizzazione di questi due complessi.Sarebbe anche interessante espandere l'approccio CLMS a un pannello di linee cellulari per identificare le interazioni proteiche mediate dall'interferone indipendenti dal tipo di cellula.Infine, abbiamo utilizzato la modellazione MD come approccio alternativo per comprendere la dinamica conformazionale delle proteine ​​coinvolte nel complesso H2BFS-HLA-A-HMGA1, che ha monitorato i cross-talk intramolecolari e intermolecolari.Le deduzioni dai dati CLMS suggeriscono la possibilità di diverse conformazioni delle proteine ​​H2BFS, HLA-A e HMGA1.Le possibili diverse conformazioni tra questi complessi proteici di aggancio hanno rivelato diverse interazioni simili a quelle osservate nel set di dati CLMS.Uno dei principali punti di forza del nostro metodo è che consente una facile identificazione di geni altamente polimorfici interagenti come HLA, quindi sarà interessante studiare le interazioni delle proteine ​​specifiche dell'aplotipo HLA che altrimenti sarebbero difficili da studiare.Nel loro insieme, i nostri dati dimostrano che il CLMS può essere utilizzato per espandere la nostra comprensione delle reti di segnalazione indotte dall'interferone e fornire una base per lo studio di sistemi intercellulari più complessi nel microambiente tumorale.
Le cellule Flo-1 sono state ottenute dall'ATCC e mantenute in DMEM (Gibco) integrato con 1% di penicillina/streptomicina (Invitrogen), 10% di siero bovino fetale (Gibco) e conservate a 37°C e 5% di CO2.Incubazione.Le cellule sono state coltivate fino a una confluenza del 70-80% prima di essere trattate con IFNα14 (prodotto dall'Edinburgh Protein Production Facility).Tutti gli altri prodotti chimici e reagenti sono stati acquistati da Sigma Aldrich se non diversamente specificato.
Le cellule Flo-1 sono state coltivate in piastre da 6 pozzetti e il giorno successivo le cellule sono state trattate con 10 ng/ml di IFNα14 per 24 ore fino a circa l'80% di confluenza.Le cellule sono state lavate tre volte con PBS e legate con DSS (Thermo Fisher Scientific) appena preparato (sciolto in DMSO) in PBS per 5 minuti a 37°C fino ad una concentrazione finale di 0,5 mM.La reazione di reticolazione del DSS è stata sostituita con PBS e il DSS residuo è stato spento aggiungendo Tris 20 mM (pH 8,0) in PBS per 15 minuti a 37°C.Le cellule sono state raccolte mediante raschiamento e raccolte in provette a basso legame (Axygen).
Il pellet cellulare è stato lisato con 300 µl di tampone di lisi di urea (urea 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale.Tutte le fasi di centrifugazione sono state eseguite a 14.000 xg a 8°C.Centrifugare il lisato per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta.Le restanti particelle trasparenti sono state sciolte in 150 μl del secondo tampone di lisi (urea 2 M, SDS (sodio dodecil solfato) al 2% (p/v)) per 30 minuti o più fino all'ottenimento di una soluzione acquosa omogenea.Il lisato è stato centrifugato per 20 minuti e il surnatante è stato miscelato con il lisato ottenuto nella fase precedente.Le concentrazioni proteiche sono state valutate utilizzando il test Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore per le procedure su micropiastra.I campioni sono stati rapidamente congelati in azoto liquido e conservati a -80°C.
Circa 100 μg di proteina reticolata solubile sono stati elaborati utilizzando un protocollo di preparazione del campione di filtrazione modificato (FASP) come descritto da Wisniewski et al.69 In breve, la proteina viene reticolata con 200 µl di tampone urea (urea 8 M in Tris 0,1 M, pH 8,5), vortexata e divisa a metà.Tutte le fasi di centrifugazione sono state eseguite a 14.000 xg a 25°C.La prima metà del lisato proteico reticolato è stato trasferito in un dispositivo di filtro centrifugo Microcon da 10 kDa dotato di una membrana Ultracel-10 (Merck), seguito da centrifugazione sul filtro per 25 minuti.Quindi aggiungere la seconda metà della proteina al filtro e ripetere gli stessi passaggi.Il recupero delle proteine ​​è stato eseguito aggiungendo 100 μl di tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP) 17 mM in tampone urea.Il recupero è stato agitato su un termomixer a 600 giri al minuto per 30 minuti a 37°C.Inoltre, la colonna è stata centrifugata e la proteina reticolata ridotta è stata alchilata utilizzando 100 μl di iodoacetamide 50 mM in tampone urea.La reazione di alchilazione è stata condotta a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.Ruotare la colonna, lavare le pareti della colonna 3 volte con 100 µl di tampone urea, quindi centrifugare.La stessa operazione è stata eseguita 3 volte utilizzando 100 μl di bicarbonato di ammonio 100 mM.Prima della trypsinizzazione, sostituire il tubo di raccolta con uno nuovo.Aggiungere tampone di digestione contenente bicarbonato di ammonio 50 mM e 1 ml di trypsin diluito in tampone trypsin (Promega).Il rapporto tripsina/proteina è stato mantenuto a circa 1:33 e le reazioni di digestione sono state incubate per una notte a 37°C in una camera umida.Il peptide reticolato è stato eluito dal filtro mediante centrifugazione per 25 minuti.Il recupero del peptide è stato migliorato aggiungendo 50 μl di NaCl 0,5 M al filtro, seguiti da centrifugazione per 25 minuti.
Le colonne C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) sono state utilizzate per dissalare i peptidi triptici reticolati seguendo il protocollo descritto da Bouchal et al.70 con piccole modifiche.In breve, le colonne spin C18 sono state attivate con tre lavaggi di acido formico (FA) allo 0,1% in acetonitrile (AcN) (Merck) e due lavaggi di acido formico allo 0,1% (FA).La colonna è stata idratata con 0,1% FA per 15 minuti.Caricare i campioni nelle colonne spin e lavare 3 volte con 0,1% FA.I peptidi dissalati sono stati eluiti in sequenza con un gradiente graduale utilizzando AcN al 50%, 80% e 100% in FA allo 0,1%.I campioni sono stati essiccati in un concentratore SpeedVac Plus (Eppendorf) fino alla completa scomparsa del liquido residuo.I peptidi eluiti sono stati sciolti in 100 μl di acido trifluoroacetico allo 0,08% in AcN al 2,5% e le concentrazioni sono state misurate su un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Circa 1 μg di peptide reticolato per campione è stato iniettato nel sistema LC-MS/MS.
I peptidi reticolati sono stati separati su un sistema LC UltiMate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific) collegato a uno spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).I peptidi reticolati sono stati raccolti su una colonna di cattura C18 pre-colonna C18 con diametro interno di 300 µm, lunga 5 mm, impaccata con adsorbente PepMap100 C18 e assorbente PepMap da 5 µm (Thermo Scientific).Caricare il flusso della pompa impostato su 5 µl/min di acido trifluoroacetico allo 0,08% disciolto in AcN al 2,5%.I peptidi reticolati sono stati separati su una colonna analitica di silice fusa con un diametro interno di 75 μm e una lunghezza di 150 mm, riempita con un adsorbente PepMap da 2 μm (Thermo Scientific).Le fasi mobili A e B erano costituite rispettivamente da 0,1% FA in acqua e 0,1% FA in acetonitrile.La pendenza inizia al 2,5% B e aumenta linearmente fino al 40% B in 90 minuti, quindi al 90% B nei successivi 2 minuti.La composizione della fase mobile è stata mantenuta al 90% di B per 10 minuti e poi è diminuita linearmente al 2,5% di B in 2 minuti.La colonna è stata equilibrata al 2,5% B per 8 minuti prima del ciclo successivo.I peptidi reticolati eluiti dalla colonna analitica sono stati ionizzati in una sorgente di ionizzazione nanoelettrospray (NSI) e iniettati in uno spettrometro di massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
Lo spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480 operava in modalità di correlazione positiva dei dati.È stata eseguita una scansione completa in modalità sezione con una risoluzione di 120.000 con impostazioni di intervallo da m/z 350 Th a m/z 2000 Th.Il target AGC normalizzato è stato fissato al 300% con un tempo di ingresso massimo di 50 ms.Per i peptidi è stato stabilito il rilevamento del picco monoisotopico.Il parametro di rilassamento del vincolo è impostato su true se vengono trovati troppo pochi precursori.La forza ionica minima del precursore è stata impostata su 5.0e3 e negli esperimenti sono stati inclusi stati di carica del precursore fino a +8.
Il tempo di ciclo tra le scansioni principali in modalità di correlazione dei dati è stato impostato su 2,5 secondi.L'esclusione dinamica della massa è stata impostata a 20 s dopo la prima frammentazione dello ione precursore.La finestra di isolamento del precursore è stata impostata su 2 Th.Il tipo di energia di collisione normalizzata con una modalità di energia di collisione fissa è stato scelto in una scansione MS/MS dipendente dai dati.Energia di collisione impostata al 30%.La risoluzione di Orbitrap è stata fissata a 15.000 e l'obiettivo AGC al 100%.Il tempo di iniezione massimo personalizzato è impostato su 60 millisecondi.
Prima di tracciare la rete proteina-proteina nei campioni reticolati, abbiamo elaborato i file grezzi utilizzando il pacchetto MaxQuant (versione 1.6.12.0)26,27 per identificare peptidi/proteine ​​tracciabili nei campioni.Inoltre, analisi proteomiche simili sono state eseguite su campioni Flo-1 non reticolati trattati e non trattati con IFNα.I dati MS/MS sono stati cercati nel database umano UniProt (www.uniprot.org) (caricato il 12 agosto 2020, contiene 75.093 voci) utilizzando il motore di ricerca integrato Andromeda27.La ricerca è stata effettuata senza indicare la specificità dell'enzima e le varie modificazioni di deammidazione (N, Q) e ossidazione (M).Le tolleranze di massa del precursore sono state fissate a 20 ppm e gli ioni prodotto a 0,02 Da.La deviazione di massa iniziale e massima è stata impostata su 10 ppm.La massa massima del peptide è stata fissata a 4600 Da e la somiglianza di sequenza è stata fissata tra 7 e 25 aminoacidi (aa).Ulteriori analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il programma Perseus (versione 1.6.10.45).Il contenuto proteico è stato calcolato normalizzando l'intensità spettrale della proteina (intensità LFQ; quantificazione senza etichetta)27 e i valori di intensità sono stati convertiti in Log2.Un cluster gerarchico di proteine ​​identificate dalla loro intensità peptidica è stato creato utilizzando il pacchetto pheatmap (v1.0.12) in R (v 4.1.2).L'analisi dell'arricchimento del percorso è stata eseguita utilizzando il database del percorso Reactome per le proteine ​​trattate con IFNα che erano attivate più di quattro volte rispetto ai campioni non trattati.
L'identificazione dei legami crociati chimici specifici della lisina (K) o della serina (S) dei complessi proteici monitorati mediante LC-MS/MS è stata eseguita utilizzando una macchina di identificazione spettroscopica (SIM-XL) per peptidi reticolati (SIM-XL)29.Innanzitutto, sono state studiate le possibili interazioni tra i geni della firma della resistenza al danno del DNA (IRDS) associati all'interferone (IFN) utilizzando il set di dati della proteina IRDS descritto in Padariya et al.28.Lo screening di tutte le condizioni e le ripetizioni dell'intero UniProt umano è un lavoro intensivo dal punto di vista computazionale, quindi l'intero database UniProt umano (www.uniprot.org) (scaricato il 12 agosto 2020, contiene 75.093 voci) rispetto alle ripetizioni trattate con IFNα.Uno dei filtri per le interazioni ad alta fiducia.Queste interazioni altamente significative ottenute sono state ampliate e testate in tutte le ripetizioni e condizioni.
In SIM-XL, DSS è stato utilizzato per il reticolante (XL) e lo spostamento del peso XL e lo spostamento del peso della modifica sono stati impostati rispettivamente su 138,06 e 156,07.Vengono considerati i seguenti siti di reazione di reticolazione: KK, KS e KN-TERM, senza ioni reporter.Sia il precursore che il frammento ppm sono stati impostati su 20 e la soglia Xrea è stata impostata su 0,15.La tripsina è stata considerata completamente specifica ed è stato implementato un metodo di frammentazione C-trap (HCD) ad alta energia.La soglia di riduzione del DB dinamico XCorr e il numero minimo di peptidi per la riduzione del DB dinamico sono stati impostati rispettivamente su 2,5 e 2.Altri parametri sono: probabilità del monoisotopo e limite di coincidenza del picco, minimo 4 residui AA per filamento e carica massima del filamento e 3 massimi di scissioni mancate.Le mappe 2D cucite risultanti sono state analizzate in (SIM-XL) e la rappresentazione grafica xQuest28 è stata utilizzata per costruire le mappe 2D.I collegamenti incrociati proteici sulle strutture proteiche sono forniti in PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versione 2.0 Schrödinger, LLC).
Le strutture del modello proteico sono state create utilizzando il server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 utilizzando i principi della modellazione dell'omologia e dell'implementazione del "Metodo Markov nascosto".Phyre2 genera strutture modello basate sull'allineamento di sequenze con strutture proteiche note.Per le proteine ​​H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 e MDN1, sono state utilizzate le strutture modello 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 e 6i2665.Inoltre è stata considerata anche la struttura di AlphaFold71 MX1, UBP18 e ROBO1.La struttura proteica è stata visualizzata utilizzando il pacchetto BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) e il pacchetto Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).