347 Tubi a spirale in acciaio inossidabile da 12,7 * 1,24 mm, meccanismo molecolare di condensazione elettrostatica sincrona e coaggregazione di α-sinucleina e tau

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Specifiche dei tubi in acciaio inossidabile 347

347 Tubi a spirale in acciaio inossidabile da 12,7 * 1,24 mm

Diametro esterno: 6,00 mm OD fino a 914,4 mm OD, dimensioni fino a 24" NB disponibile a magazzino, tubi in acciaio con diametro esterno disponibili a magazzino

Intervallo di spessore del tubo SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
PESO: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ecc. (0,5-12 mm) O dimensioni non regolari da personalizzare secondo necessità

Tipo: Tubi senza saldatura SS 347 |Tubi SS 347 ERW |Tubi Saldati SS 347 |Tubi fabbricati SS 347 |Tubi SS 347 CDW, tubi LSAW/saldati continuativi/ridisegnati

Forma: Tubi/tubi tondi SS 347, Tubi/tubi quadrati SS 347, Tubi/tubi rettangolari SS 347, Tubi a spirale SS 347, Forma a “U” SS 347, Bobine Pan Cake SS 347, Tubi idraulici SS 347

Lunghezza: singola casuale, doppia casuale e lunghezza richiesta: estremità liscia, estremità smussata, con gradino

Protezione finale: cappucci in plastica |Finitura esterna: Finitura a specchio 2B, N.4, N.1, N.8 per tubi in acciaio inossidabile, finitura secondo i requisiti del cliente

Condizioni di consegna: ricotto e decapato, lucidato, ricotto brillante, trafilato a freddo

Ispezione, Rapporti di prova: Certificati di prova di macinazione, EN 10204 3.1, Rapporti chimici, Rapporti meccanici, Rapporti di prova PMI, Rapporti di ispezione visiva, Rapporti di ispezione di terze parti, Rapporti di laboratorio approvati NABL, Rapporto di prova distruttiva, Rapporti di prova non distruttiva

Imballaggio: imballato in scatole di legno, sacchetti di plastica, strisce di acciaio impacchettate o secondo le richieste dei clienti

Speciali: dimensioni e specifiche diverse da quelle sopra indicate possono essere realizzate su richiesta

Intervallo di dimensioni del tubo SS 347: 1/2 pollice NB, diametro esterno fino a 24 pollici

ASTM A312 347: Tubi austenitici saldati senza saldatura e con giunzioni diritte destinati ad alte temperature e a servizi corrosivi generali.Metallo d'apporto non consentito durante la saldatura.

ASTM A358 347: Tubo austenitico saldato per fusione elettrica per servizio corrosivo e/o ad alta temperatura.Solitamente vengono prodotti solo tubi fino a 8 pollici secondo queste specifiche.Durante la saldatura è consentita l'aggiunta di metallo d'apporto.

ASTM A790 347: Tubi ferritici/austenitici (duplex) saldati senza saldatura e con giunzioni diritte destinati ad un servizio corrosivo generale, con particolare enfasi sulla resistenza alla tensocorrosione.

ASTM A409 347: Tubi austenitici a parete leggera di grande diametro saldati per fusione elettrica con aggraffatura diritta o a spirale nelle dimensioni da 14" a 30" con pareti Sch5S e Sch 10S per ambienti corrosivi e/o ad alta resistenza

ASTM A376 347: Tubo austenitico senza saldatura per applicazioni ad alta temperatura.

ASTM A813 347: Tubo austenitico a cucitura singola, saldata singola o doppia per applicazioni ad alta temperatura e corrosive generali.

ASTM A814 347: tubo austenitico saldato lavorato a freddo per alte temperature e servizio corrosivo generale.

Composizione chimica dei tubi in acciaio inossidabile 347H

Proprietà meccaniche dei tubi in acciaio inossidabile 347H

Proprietà fisiche dei tubi in acciaio inossidabile 347H

Gradi equivalenti per tubi in acciaio inossidabile 347H

L'aggregazione dell'amiloide alfa-sinucleina (αS) è un segno distintivo della malattia di Parkinson e di altre sinucleinopatie.Recentemente, la proteina tau comunemente associata alla malattia di Alzheimer è stata associata alla patologia αS e si è scoperto che co-localizza in inclusioni ricche di αS, sebbene il meccanismo molecolare di coaggregazione delle due proteine ​​rimanga poco chiaro.Riportiamo qui che la fase αS si separa in condensati liquidi tramite condensazione di complessi elettrostatici con polipeptidi caricati positivamente come tau.A seconda dell’affinità di αS per i policationi e della velocità di deplezione della valenza della rete di coagulazione, i coaguli subiscono una rapida gelificazione o coalescenza seguita da una lenta aggregazione amiloide.Combinando una serie di tecniche biofisiche avanzate, siamo stati in grado di caratterizzare la separazione di fase liquido-liquido αS/Tau e identificare i fattori chiave che portano alla formazione di aggregati eterogenei contenenti entrambe le proteine ​​in un condensato proteico liquido.
Oltre ai compartimenti della membrana, la separazione spaziale nelle cellule può essere ottenuta anche mediante la formazione di corpi densi simili a liquidi, ricchi di proteine, chiamati condensati o goccioline biomolecolari, attraverso un processo noto come separazione di fase liquido-liquido (LLPS).Queste goccioline sono formate da interazioni temporali multivalenti, solitamente tra proteine ​​o proteine ​​e RNA, e svolgono una varietà di funzioni in quasi tutti i sistemi viventi.Un gran numero di proteine ​​capaci di LLP presentano sequenze di bassa complessità altamente disordinate in natura e nella formazione di condensati biomolecolari3,4,5.Numerosi studi sperimentali hanno rivelato la natura flessibile, spesso disordinata e multivalente delle proteine ​​che compongono questi condensati di tipo liquido, sebbene si sappia poco sui determinanti molecolari specifici che controllano la crescita e la maturazione di questi condensati in uno stato più solido. stato..
I nuovi dati supportano l’ipotesi che l’LLPS aberrante guidato dalle proteine ​​e la trasformazione delle goccioline in strutture solide possano essere percorsi cellulari rilevanti che portano alla formazione di aggregati tossici insolubili che sono spesso segni distintivi di malattie degenerative.Molte proteine ​​intrinsecamente disordinate (IDP) associate a LLPS, spesso altamente cariche e flessibili, sono state a lungo associate alla neurodegenerazione attraverso il processo di aggregazione dell'amiloide.In particolare, è stato dimostrato che i condensati biomolecolari di IDP come FUS7 o TDP-438 o proteine ​​con domini ampi e a bassa complessità come hnRNPA19 invecchiano in forme gelatinose o addirittura solide attraverso un processo chiamato fluidizzazione.composto.alla transizione di fase solida (LSPT) in funzione del tempo o in risposta a determinate modifiche post-traduzionali o mutazioni patologicamente significative1,7.
Un altro IDP associato a LLPS in vivo è Tau, una proteina disordinata associata ai microtubuli la cui aggregazione amiloide è stata implicata nella malattia di Alzheimer10 ma è stata recentemente implicata anche nella malattia di Parkinson (MdP) e altre proteine ​​nucleari sinaptiche11, 12, 13 sono correlate.È stato dimostrato che la tau si dissocia spontaneamente dalla soluzione/citoplasma a causa di interazioni elettrostatiche favorevoli14, determinando la formazione di goccioline arricchite di tau note come coacervati elettrostatici.È stato inoltre osservato che questo tipo di interazione non specifica è la forza trainante di molti condensati biomolecolari in natura15.Nel caso di una proteina tau, l'aggregazione elettrostatica può essere formata mediante aggregazione semplice, in cui regioni della proteina caricate in modo opposto innescano il processo di scissione, o mediante aggregazione complessa attraverso l'interazione con polimeri caricati negativamente come l'RNA.
Recentemente, l'α-sinucleina (αS), un IDP amiloide implicato nella malattia di Parkinson e in altre malattie neurodegenerative note collettivamente come sinucleinopatia17,18, è stato dimostrato in modelli cellulari e animali19,20 concentrato in condensati proteici con comportamento simile a un fluido.Studi in vitro hanno dimostrato che αS subisce LLPS mediante semplice aggregazione attraverso interazioni prevalentemente idrofobiche, sebbene questo processo richieda concentrazioni proteiche eccezionalmente elevate e tempi di incubazione atipicamente lunghi19,21.Se i condensati contenenti αS osservati in vivo siano formati da questo o da altri processi LLPS rimane una questione chiave irrisolta.Allo stesso modo, sebbene l’aggregazione amiloide di αS sia stata osservata nei neuroni della malattia di Parkinson e di altre sinucleinopatie, l’esatto meccanismo attraverso il quale αS subisce l’aggregazione amiloide intracellulare rimane poco chiaro, poiché la sovraespressione di questa proteina non sembra innescare questo processo da sola.Spesso è necessario un ulteriore danno cellulare, suggerendo che determinate posizioni cellulari o microambienti sono necessari per la rinucleazione dei gruppi amiloidi αS intracellulari.Un ambiente cellulare particolarmente incline all'aggregazione potrebbe essere l'interno dei condensati proteici 23 .
È interessante notare che è stato scoperto che αS e tau co-localizzano in inclusioni caratteristiche della malattia negli esseri umani con malattia di Parkinson e altre sinucleinopatie 24,25 e gli esperimenti hanno riportato una relazione patologica sinergica tra le due proteine ​​26,27 suggerendo una potenziale relazione tra l'aggregazione αS e tau nelle malattie neurodegenerative.malattia.È stato scoperto che αS e tau interagiscono e promuovono l'aggregazione reciproca in vitro e in vivo 28,29 e aggregati eterogenei composti da queste due proteine ​​sono stati osservati nel cervello di pazienti con sinucleinopatie 30 .Tuttavia, si sa poco sulle basi molecolari dell'interazione tra αS e tau e sul meccanismo della sua coaggregazione.È stato riportato che αS interagisce con tau attraverso un'attrazione elettrostatica tra la regione C-terminale di αS altamente caricata negativamente e la regione centrale ricca di prolina di tau, che è anch'essa arricchita di residui caricati positivamente.
In questo studio, mostriamo che αS può effettivamente dissociarsi in goccioline tramite condensazione del complesso elettrostatico in presenza della proteina tau, in contrasto con la sua interazione con altri polipeptidi caricati positivamente come la poli-L-lisina (pLK), e in questo processo.αS funge da molecola di impalcatura per la rete di goccioline.Abbiamo identificato differenze notevoli nel processo di maturazione dei coacervati elettrostatici αS, che sono associati a differenze nella valenza e nella forza dell'interazione delle proteine ​​coinvolte nella rete coacervata.È interessante notare che abbiamo osservato la co-aggregazione delle proteine ​​amiloide αS e tau in coacervati liquidi a lunga vita e identificato alcuni fattori chiave che portano alla co-aggregazione di queste due proteine ​​in tali coacervati.Qui descriviamo in dettaglio questo processo, che è un possibile meccanismo molecolare alla base della colocalizzazione di due proteine ​​in inclusioni specifiche della malattia.
αS ha una coda C-terminale altamente anionica a pH neutro (Fig. 1a) e abbiamo ipotizzato che potrebbe subire LLPS attraverso la condensazione di complessi elettrostatici con molecole polipeptidiche disordinate policationiche.Abbiamo utilizzato una poli-L-lisina (pLK) da 100 residui come molecola modello di partenza a causa della sua natura polimerica caricata positivamente e disordinata a pH neutro 32. Innanzitutto, abbiamo confermato che pLK interagisce con il dominio Ct di αS tramite spettroscopia NMR in soluzione (Figura 1b) utilizzando αS marcato con 13C/15N in presenza di rapporti molari αS:pLK crescenti.L'interazione di pLK con il dominio Ct di αS si manifesta in perturbazioni del Chemical Shift e in una diminuzione dell'intensità del picco in questa regione della proteina.È interessante notare che quando abbiamo mescolato αS con pLK ad una concentrazione di αS di ca.5–25 µM in presenza di polietilenglicole (5–15% PEG-8) (tipico tampone LLPS: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) abbiamo immediatamente attraversato un ampio campo di formazione di proteine .le goccioline sono state osservate utilizzando la microscopia a fluorescenza (WF) e in campo chiaro (BF) (Fig. 1c).Goccioline da 1-5 µm contenenti αS concentrato (aggiunto αS marcato con AlexaFluor488 da 1 µM, AF488-αS), le loro proprietà elettrostatiche possono essere derivate dalla loro resistenza all'1,6-esandiolo al 10% (1,6-HD) e dalla sua sensibilità a un aumento della concentrazione di NaCl (Fig. 1c).La natura fluida dei coacervati del complesso elettrostatico αS/pLK è dimostrata dalla loro capacità di fondersi in millisecondi (Fig. 1d).Utilizzando la turbidimetria, abbiamo quantificato la formazione di goccioline in queste condizioni, confermato la natura elettrostatica dell'interazione principale associata alla sua stabilità (Fig. 1e) e valutato l'effetto di vari rapporti polimerici sul processo LLPS (Fig. 1f).Sebbene la formazione di goccioline sia osservata in un’ampia gamma di rapporti polimerici, il processo è molto favorevole quando pLK è superiore a αS.Sono stati osservati LLP anche utilizzando l'agente di spostamento chimicamente diverso destrano-70 (70 kDa) o utilizzando una varietà di formati di campione, tra cui gocce di vetrini, pozzetti per micropiastre di vari materiali, capillari Eppendorf o quarzo.
una rappresentazione schematica di diverse regioni proteiche nelle varianti WT-αS e ΔCt-αS utilizzate in questo studio.Il dominio N-terminale anfipatico, la regione idrofobica che forma amiloide (NAC) e il dominio C-terminale caricato negativamente sono mostrati rispettivamente in blu, arancione e rosso.Viene mostrata la mappa della carica netta per residuo (NCPR) di WT-αS.b Analisi NMR dell'interazione αS/pLK in assenza di grumi macromolecolari.All'aumentare della concentrazione di pLK (i rapporti molari αS:pLK di 1:0,5, 1:1,5 e 1:10 sono mostrati rispettivamente in verde chiaro, verde e verde scuro).c Coacervato αS/pLK (rapporto molare 1:10) a 25 µM (1 µM αS marcato con AF488 o pLK marcato con Atto647N per l'imaging WF) in tampone LLPS (in alto) o integrato con NaCl 500 mM (in basso a sinistra) o dopo 10 % 1,6-esandiolo (1,6-HD; in basso a destra).Barra della scala = 20 µm.d Immagini microscopiche rappresentative della fusione di goccioline BF di αS/pLK (rapporto molare 1:10) ad una concentrazione di 25 μM;le frecce indicano l'unione delle singole gocce (frecce rosse e gialle) in una nuova goccia (freccia arancione) entro 200 ms).Barra della scala = 20 µm.e Aggregazione αS/pLK di scattering della luce (a 350 nm) nel tampone LLPS prima e dopo l'aggiunta di NaCl 500 mM o 1,6-HD al 10% a αS 25 µM (N = 3 repliche del campione, sono indicate anche la media e la deviazione standard).f Immagine BF (in alto) e analisi di diffusione della luce (a 350 nm, in basso) dell'aggregazione αS/pLK a 25 μM αS con rapporto molare αS:pLK crescente (N = 3 repliche del campione, sono indicate anche la media e la deviazione standard).Barra della scala = 10 µm.La barra della scala su un'immagine indica la scala di tutte le immagini in un pannello.I dati grezzi vengono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
Sulla base delle nostre osservazioni sulla condensazione del complesso elettrostatico αS/pLK e precedenti osservazioni di αS come molecola cliente del condensato tau/RNA attraverso l'interazione diretta con tau31, abbiamo ipotizzato che αS e tau potrebbero co-segregare con il solvente in assenza di RNA condensazione.attraverso complessi elettrostatici e αS è la proteina dell'impalcatura nei coacervati αS/Tau (vedere la distribuzione della carica tau nella Figura 2e).Abbiamo osservato che quando 10 μM αS e 10 μM Tau441 (contenenti rispettivamente 1 μM AF488-αS e 1 μM Atto647N-Tau) sono stati mescolati insieme nel buffer LLPS, hanno formato facilmente aggregati proteici contenenti entrambe le proteine, come visto dalla microscopia WF.(Fig. 2a).La colocalizzazione delle due proteine ​​nelle goccioline è stata confermata mediante microscopia confocale (CF) (Figura 1a supplementare).Un comportamento simile è stato osservato quando destrano-70 è stato utilizzato come agente di aggregazione (Figura 1c supplementare).Utilizzando PEG o destrano marcati con FITC, abbiamo scoperto che entrambi gli agenti di affollamento erano distribuiti uniformemente tra i campioni, non mostrando né segregazione né associazione (Figura 1d supplementare).Piuttosto, suggerisce che in questo sistema promuovono la separazione di fase attraverso effetti di affollamento macromolecolari, poiché il PEG è un agente di affollamento preferenzialmente stabile, come visto in altri sistemi LLP33,34.Queste goccioline ricche di proteine ​​erano sensibili a NaCl (1 M) ma non a 1,6-HD (10% v/v), confermando le loro proprietà elettrostatiche (Figura 2a, b supplementare).Il loro comportamento fluido è stato confermato osservando eventi di goccioline che si uniscono in millisecondi utilizzando la microscopia BF (Fig. 2b).
a Immagini al microscopio confocale (CF) di coacervati αS/Tau441 nel buffer LLPS (10 μM di ciascuna proteina, 0,5 μM di αS marcato con AF488 e Tau441 marcato con Atto647N).b Immagini rappresentative del contrasto di interferenza differenziale (DIC) degli eventi di fusione delle goccioline αS / Tau441 (10 μM per ciascuna proteina).c Diagramma di fase basato sulla diffusione della luce (a 350 nm) di Tau441 LLPS (0–15 µM) in assenza (a sinistra) o presenza (a destra) di 50 µM αS.I colori più caldi indicano una maggiore dispersione.d Diffusione della luce di campioni LLPS αS/Tau441 con concentrazione crescente di αS (Tau441 a 5 µM, N = 2–3 ripetizioni del campione come indicato).e Rappresentazione schematica di alcune varianti della proteina tau e di diverse regioni della proteina utilizzata in questo studio: dominio N-terminale caricato negativamente (rosso), regione ricca di prolina (blu), dominio di legame dei microtubuli (MTBD, evidenziato in arancione) e spirale della coppia che forma l’amiloide.regioni di filamenti (PHF) situate all'interno dell'MTBD (grigio).Viene mostrata la mappa Net Charge Per Residue (NCPR) di Tau441.f Utilizzando 1 µM di αS marcato con AF488 e ΔNt- etichettato con Atto647N, utilizzando 1 µM di αS o ΔCt-αS marcati con AF488 in presenza di ΔNt-Tau (in alto, 10 µM per proteina) o K18 (in basso, 50 µM per proteina ) ) ) micrografie di WF condensate in buffer LLPS o K18.Le barre della scala in un'immagine rappresentano la scala di tutte le immagini in un pannello (20 µm per i pannelli a, bef).I dati grezzi per i pannelli c e d vengono forniti come file di dati grezzi.
Per testare il ruolo di αS in questo processo LLPS, abbiamo prima studiato l'effetto di αS sulla stabilità delle goccioline mediante nefelometria utilizzando concentrazioni crescenti di NaCl (Fig. 2c).Maggiore è la concentrazione di sale nei campioni contenenti αS, maggiori sono i valori di diffusione della luce (a 350 nm), che indicano il ruolo stabilizzante di αS in questo sistema LLPS.Un effetto simile può essere osservato aumentando la concentrazione di αS (e quindi il rapporto αS:Tau441) a ca.Aumento di 10 volte rispetto alla concentrazione di tau (5 µM) (Fig. 2d).Per dimostrare che αS è una proteina dell'impalcatura nei coacervati, abbiamo deciso di studiare il comportamento del mutante Tau interrotto da LLPS, che manca di una regione N-terminale carica negativamente (residui 1–150, vedere Fig. 2e) chiamata ΔNt-Tau.La microscopia e la nefelometria WF hanno confermato che ΔNt-Tau stesso non è stato sottoposto a LLPS (Fig. 2f e Fig. 2d supplementare), come precedentemente riportato 14. Tuttavia, quando αS è stato aggiunto alle soluzioni di dispersione di questa variante Tau troncata, il processo LLPS è stato completamente ripristinato con densità di goccioline vicina alla densità di goccioline di soluzioni a grandezza naturale di Tau e αS in condizioni e concentrazioni proteiche simili.Questo processo può essere osservato anche in condizioni di basso affollamento macromolecolare (Figura 2c supplementare).Il ruolo della regione αS C-terminale, ma non della sua intera lunghezza, nel processo LLPS è stato dimostrato dall'inibizione della formazione di goccioline utilizzando una variante αS troncata C-terminale priva di residui 104-140 (Fig. 1a) del (ΔCt- Proteina αS) (Fig. 2f e Fig. 2d supplementare).La colocalizzazione di αS e ΔNt-Tau è stata confermata mediante microscopia a fluorescenza confocale (Figura 1b supplementare).
Per testare ulteriormente il meccanismo LLPS tra Tau441 e αS, è stata utilizzata un'ulteriore variante Tau, vale a dire il frammento del nucleo di filamento elicoidale (PHF) accoppiato nel dominio di legame dei microtubuli (MTBD), che se contiene quattro domini ripetuti caratteristici, comunemente noti anche come il frammento K18 (vedi Fig. 2e).È stato recentemente riportato che αS si lega preferenzialmente a una proteina tau situata in un dominio ricco di prolina in una sequenza che precede il dominio di legame dei microtubuli.Tuttavia, la regione PHF è anche ricca di residui caricati positivamente (vedere Figura 2e), in particolare lisina (residui del 15%), il che ci ha spinto a verificare se questa regione contribuisce anche alla condensazione del complesso αS/Tau.Abbiamo osservato che il K18 da solo non poteva attivare LLPS a concentrazioni fino a 100 μM nelle condizioni testate (tampone LLPS con 15% PEG o 20% destrano) (Figura 2f).Tuttavia, quando abbiamo aggiunto 50 µM αS a 50 µM K18, è stata osservata una rapida formazione di goccioline proteiche contenenti K18 e αS mediante nefelometria (Figura 2d supplementare) e microscopia WF (Figura 2f).Come previsto, ΔCt-αS non è stato in grado di ripristinare il comportamento LLPS di K18 (Fig. 2f).Notiamo che l'aggregazione αS/K18 richiede concentrazioni proteiche leggermente più elevate per indurre LLPS rispetto a αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, a parità di altre condizioni.Ciò è coerente con una più forte interazione della regione C-terminale αS con il dominio Tau ricco di prolina rispetto al dominio di legame dei microtubuli, come descritto in precedenza 31.
Dato che ΔNt-Tau non può eseguire LLPS in assenza di αS, abbiamo scelto questa variante Tau come modello per caratterizzare l'LLPS αS/Tau data la sua semplicità nei sistemi LLPS con Tau a lunghezza intera (isotipo, Tau441/Tau441).con processi di aggregazione complessi (eterotipici, αS/Tau441).Abbiamo confrontato il grado di aggregazione di αS (come parte della proteina di fase condensata, fαS,c) nei sistemi αS/Tau e αS/ΔNt-Tau mediante centrifugazione e analisi SDS-PAGE in fase dispersa (vedere 2e), riscontrando valori molto simili per tutte le proteine ​​alla stessa concentrazione.In particolare, abbiamo ottenuto fαS,c 84 ± 2% e 79 ± 7% rispettivamente per αS/Tau e αS/ΔNt-Tau, suggerendo che l'interazione eterotipica tra αS e tau è superiore all'interazione tra le molecole di tau.fra.
L'interazione con vari policationi e l'effetto del processo di condensazione sulla cinetica di αS sono stati studiati per la prima volta mediante il metodo di recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP).Abbiamo testato i coacervati αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK (100 μM αS integrati con 2 μM αS AF488-αS e 100 μM Tau441 o ΔNt-Tau o 1 mM pLK).I dati sono stati ottenuti entro i primi 30 minuti dopo la miscelazione dei componenti del campione.Dalle immagini FRAP rappresentative (Fig. 3a, condensazione αS / Tau441) e le corrispondenti curve del decorso temporale (Fig. 3b, Figura 3 supplementare), si può vedere che la cinetica αS è molto simile a quella dei coacervati Tau441.e ΔNt-Tau, che è molto più veloce con pLK.I coefficienti di diffusione calcolati per αS all'interno del coacervato secondo FRAP (come descritto da Kang et al. 35) sono D = 0,013 ± 0,009 µm2/s e D = 0,026 ± 0,008 µm2/s per αS/Tau441 e αS/ΔNt- per il sistema αS/.pLK, Tau e D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, rispettivamente (Fig. 3c).Tuttavia, il coefficiente di diffusione αS nella fase dispersa è di diversi ordini di grandezza superiore rispetto a tutte le fasi condensate, come determinato mediante spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS, vedere Figura 3 supplementare) nelle stesse condizioni (tampone LLPS) ma in assenza di policationi (D = 8 ± 4 µm2/s).Pertanto, la cinetica della traduzione di αS è significativamente ridotta nei coacervati rispetto alle proteine ​​nella fase dispersa a causa dei pronunciati effetti di affollamento molecolare, sebbene tutti i coacervati mantengano proprietà liquide durante la prima mezz'ora dopo la loro formazione, a differenza della fase tau.cinetica più veloce nel condensato pLK.
a–c Analisi FRAP della dinamica αS (2% αS marcato con AF488) in coacervati elettrostatici.Immagini rappresentative dei test FRAP αS/Tau441 in triplice copia sono mostrate in (a), dove i cerchi rossi indicano aree decolorate.La barra della scala è 5 µm.b Curve FRAP medie e (c) coefficienti di diffusione calcolati (D) per 5-6 (N) goccioline diverse da tre esperimenti utilizzando αS da 100 µM e concentrazioni equimolari di Tau441 (rosso) o ΔNt-Tau (blu) o pLK (verde) a dieci volte la concentrazione di LLPS.La deviazione standard della curva FRAP è mostrata in colore ombreggiato.Per confronto, il coefficiente di diffusione αS nella fase dispersa è stato determinato in triplicato utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS) (vedere Figura 3 supplementare e metodi per ulteriori informazioni).d Spettri EPR continui in banda X di 100 μM TEMPOL-122-αS nel buffer LLPS senza alcun policatione (nero) o in presenza di 100 μM Tau441 (rosso) o ΔNt-Tau (blu) o 1 mM pLK (verde).L'inserto mostra una vista ingrandita delle forti linee di campo dove si verificano i cambiamenti più drammatici.e Curve di legame di TEMPOL-122-αS da 50 μM con vari policationi in assenza di LLPS (no PEG).È stato dimostrato che l'ampiezza ridotta della banda III rispetto alla banda II (IIII/III) dello spettro EPR normalizzato aumenta i rapporti molari di Tau441 (rosso), ΔNt-Tau (blu) e pLK (verde).Le linee colorate mostrano l'adattamento ai dati utilizzando un modello di legame approssimativo con n siti di legame identici e indipendenti su ciascuna curva.I dati grezzi vengono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
Come complemento, abbiamo studiato la dinamica di αS in vari coacervati utilizzando l'etichettatura dello spin diretta (SDSL) e la risonanza paramagnetica elettronica continua (CW-EPR).Questo metodo si è dimostrato molto utile nel riportare la flessibilità e la dinamica dell'IDP con una risoluzione residua realistica36,37,38.A tal fine, abbiamo costruito residui di cisteina in singoli mutanti Cys e utilizzato la sonda di spin 4-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-ossile (TEMPOL).I derivati ​​​​della maleimmide li etichettano.Più specificamente, abbiamo inserito le sonde TEMPOL nella posizione 122 o 24 αS (TEMPOL-122-αS e TEMPOL-24-αS).Nel primo caso, miriamo alla regione C-terminale della proteina, coinvolta nell'interazione con i policationi.La posizione 24 può invece darci informazioni sulla dinamica complessiva delle proteine ​​nel condensato.In entrambi i casi, i segnali EPR ottenuti per le proteine ​​della fase dispersa corrispondevano ai radicali nitrossido nello stato in rapido movimento.Dopo la separazione di fase in presenza di tau o pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 o ΔNt-Tau con un rapporto di 1:1 o pLK con un rapporto di 1:10), è stato osservato un aumento dell'intensità relativa del picco in lo spettro EPR di αS.La linea di perdita si è ampliata, indicando una ridotta cinetica di riorientamento αS nelle goccioline rispetto alla proteina in fase diluita (Fig. 3d, Figura 4a supplementare).Questi cambiamenti sono più pronunciati nella posizione 122. Mentre nella posizione 24 la presenza di pLK non ha influenzato la cinetica della sonda, nella posizione 122 la forma della linea spettrale è cambiata in modo significativo (Figura 4a supplementare).Quando abbiamo tentato di modellare gli spettri nella posizione 122 di due sistemi αS/policatione utilizzando il modello isotropo (Figura 5a supplementare) comunemente usato per descrivere la dinamica dell'IDP38,39 marcato con spin, non siamo stati in grado di ricostruire gli spettri sperimentali..Simulazione spettrale della posizione di 24 contrasti di spin (Figura 5a supplementare).Ciò suggerisce che ci siano posizioni preferenziali nello spazio delle configurazioni di spin della regione C-terminale di αS in presenza di policationi.Quando si considera la frazione di αS nella fase condensata in condizioni EPR sperimentali (84 ± 2%, 79 ± 7% e 47 ± 4% per αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK, rispettivamente, vedere Supplemento Fig. 2e dell'analisi dei dati c), si può vedere che l'allargamento rilevato dal metodo EPR riflette principalmente l'interazione della regione C-terminale di αS con vari policationi nella fase condensata (il cambiamento principale quando si utilizza TEMPOL-122- αS) e non condensazione proteica.Nella sonda si osserva un aumento della microviscosità.Come previsto, lo spettro EPR della proteina in condizioni diverse da LLPS è stato completamente ripristinato quando alla miscela è stato aggiunto NaCl 1 M (Figura 4b supplementare).Nel complesso, i nostri dati suggeriscono che i cambiamenti rilevati da CW-EPR riflettono principalmente l'interazione della regione C-terminale di αS con vari policationi nella fase condensata, e questa interazione sembra essere più forte con pLK che con Tau.
Per ottenere maggiori informazioni strutturali sulle proteine ​​nel coacervato, abbiamo deciso di studiare il sistema LLPS utilizzando NMR in soluzione.Tuttavia, abbiamo potuto rilevare solo la frazione αS rimanente nella fase dispersa, il che potrebbe essere dovuto alla ridotta dinamica proteica all'interno del coacervato e ad una fase densa sul fondo della soluzione nell'analisi NMR.Quando abbiamo analizzato la struttura e la dinamica della proteina rimanente nella fase dispersa del campione LLPS utilizzando NMR (Figura 5c, d supplementare), abbiamo notato che la proteina si comportava in modo quasi identico in presenza di pLK e ΔNt-Tau, entrambi di che erano nella struttura secondaria e nella dinamica della struttura proteica, rivelati da esperimenti sullo spostamento chimico secondario e sul rilassamento R1ρ.I dati NMR mostrano che il C-terminale di αS subisce una significativa perdita di flessibilità conformazionale pur mantenendo la sua natura disordinata, come il resto della sequenza proteica, a causa delle sue interazioni con i policationi.
Poiché l'ampliamento del segnale CW-EPR osservato nella fase condensata TEMPOL-122-αS riflette l'interazione della proteina con i policationi, abbiamo eseguito una titolazione EPR per valutare l'affinità di legame di αS con vari policationi in assenza di LLPS (nessun accumulo di Buffer LLPS), suggerendo che le interazioni sono le stesse nelle fasi diluite e concentrate (il che è confermato dai nostri dati, Figura 4a supplementare e Figura 6 supplementare).L'obiettivo era vedere se tutti i coacervati, nonostante le loro proprietà comuni simili a fluidi, mostrassero un comportamento differenziale sottostante a livello molecolare.Come previsto, lo spettro EPR si è ampliato con l'aumento della concentrazione di policationi, riflettendo una diminuzione della flessibilità molecolare dovuta alle interazioni molecolari di tutti i partner di interazione quasi fino alla saturazione (Fig. 3e, Figura 6 supplementare).pLK ha raggiunto questa saturazione con un rapporto molare inferiore (policatione:αS) rispetto a ΔNt-Tau e Tau441.Infatti, il confronto dei dati con un modello di legame approssimativo che assume n siti di legame identici e indipendenti ha mostrato che la costante di dissociazione apparente di pLK (~5 μM) è un ordine di grandezza inferiore a quella di Tau441 o ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Sebbene questa sia una stima approssimativa, ciò suggerisce che αS ha una maggiore affinità per i policationi più semplici con regioni continue di carica positiva.Data questa differenza di affinità tra αS e vari policationi, abbiamo ipotizzato che le loro proprietà liquide possano cambiare in modo diverso nel tempo e quindi soffrire di diversi processi LSPT.
Dato l'ambiente altamente affollato all'interno del coacervato proteico e la natura amiloide della proteina, abbiamo osservato il comportamento del coacervato nel tempo per rilevare possibili processi LSPT.Utilizzando la microscopia BF e CF (Figura 4), abbiamo osservato che αS/Tau441 coacerva in larga misura in soluzione, formando grandi goccioline che entrano in contatto e bagnano la superficie sul fondo del pozzetto/vetrino come goccioline piene, come previsto (Figura complementare .7d);chiamiamo queste strutture formate sul fondo “zattere proteiche”.Queste strutture sono rimaste fluide poiché hanno mantenuto la capacità di fondersi (Figura 7b supplementare) e potevano essere viste per diverse ore dopo l'attivazione di LLPS (Figura 4 e Figura 7c supplementare).Abbiamo osservato che il processo di bagnatura è favorito sulla superficie di materiali idrofili piuttosto che idrofobi (Figura 7a supplementare), come previsto per coacervati elettrostatici con cariche sbilanciate e quindi elevati potenziali superficiali elettrostatici.In particolare, la coalescenza e il rafting di αS/ΔNt-Tau sono stati significativamente ridotti, mentre i condensati di αS/pLK sono stati significativamente ridotti (Fig. 4).Durante il breve tempo di incubazione, le goccioline di αS/pLK sono state in grado di coalescere e bagnare la superficie idrofila, ma questo processo si è interrotto rapidamente e dopo 5 ore di incubazione sono stati osservati solo eventi di coalescenza limitati e nessuna bagnatura.– transizione gel-gocciolamento.
BF rappresentativo (pannelli in scala di grigi) e CF (pannelli di destra, αS etichettati con AF488 in verde) di campioni coacervati contenenti 100 µM di αS (etichetta fluorescente all'1%) in tampone LLPS in presenza di 100 µM di fluorescenza Tau441 (in alto)) immagini microscopiche ΔNt -Tau (al centro) o 1 mM pLK (in basso) a diversi tempi di incubazione e altezze focali (z, distanza dal fondo del pozzetto della piastra).Gli esperimenti sono stati ripetuti 4-6 volte indipendentemente l'uno dall'altro con gli stessi risultati.I coacervati αS/Tau441 vengono bagnati dopo 24 ore, formando zattere più grandi dell'immagine.La barra della scala per tutte le immagini è 20 µm.
Abbiamo quindi chiesto se i grandi pool proteici simili a fluidi formati in αS/Tau441 LLPS avrebbero portato all'aggregazione amiloide di una qualsiasi delle proteine ​​studiate.Abbiamo seguito la maturazione delle goccioline αS / Tau441 nel tempo con la microscopia WF nelle stesse condizioni di cui sopra, ma utilizzando αS marcato con AF488 da 1 μM e Tau441 marcato con Atto647N (Fig. 5a).Come previsto, abbiamo osservato la completa localizzazione delle proteine ​​durante tutto il processo di maturazione.È interessante notare che da ca.Dopo 5 ore, all'interno delle zattere sono state osservate strutture non circolari più intense, che abbiamo chiamato “punti”, alcune delle quali erano colocalizzate con αS, e alcune erano arricchite in Tau441 (Fig. 5a, frecce bianche).Questi punti sono sempre stati osservati all'interno delle zattere in misura maggiore per αS/ΔNt-Tau che per αS/ΔNt-Tau.Non c'erano punti distinti nelle goccioline dei sistemi pLK e Tau incompetenti per la fusione/bagnatura.Per verificare se queste macchie contenenti αS e Tau441 sono aggregati simili all'amiloide, abbiamo eseguito un esperimento simile utilizzando la microscopia CF in cui Tau441 è stato etichettato con Atto647N e 12,5 μM di tioflavina-T (ThT) specifica per l'amiloide è stata aggiunta dall'inizio.tintura.Sebbene la colorazione ThT delle goccioline o delle zattere αS/Tau441 non sia stata osservata anche dopo 24 ore di incubazione (Fig. 5b, riga superiore: goccioline rimanenti sulle zattere proteiche), le strutture ThT positive contenenti Atto647N-Tau441 all'interno delle zattere erano molto deboli.questo replica la dimensione, la forma e la posizione delle macchie precedentemente descritte (Fig. 5b, file centrale e inferiore), suggerendo che le macchie possono corrispondere ad aggregati simili all'amiloide formati nei coacervati fluidi dell'invecchiamento.
WF 25 μM αS a vari tempi di incubazione e altezze focali (z, distanza dal fondo non legato) in presenza di 25 μM Tau441 (1 μM αS etichettato AF488 e Tau441 etichettato Atto647N) in un pozzetto di una piastra per microscopio con tampone LLPS) .Sei esperimenti sono stati ripetuti in modo indipendente con risultati simili.b Immagine microscopica CF di 25 μM αS in presenza di 25 μM Tau441 (1 μM Tau441 marcato con Atto647N) e 12,5 μM di tioflavina-T (ThT).Le goccioline proteiche pesate, i raft e gli spot proteici depositati sono mostrati rispettivamente nelle righe superiore e centrale.La riga inferiore mostra immagini di zattere e gocce da 3 repliche indipendenti.Le frecce bianche indicano punti ThT positivi in ​​entrambi i pannelli.La barra della scala per tutte le immagini è 20 µm.
Per esaminare più in dettaglio i cambiamenti nella rete proteica coacervata durante la transizione da liquido a solido, abbiamo utilizzato l'imaging a fluorescenza (FLIM) e la microscopia a trasferimento di energia a risonanza Förster (FRET) (Figura 6 e Figure supplementari 8 e 9).Abbiamo ipotizzato che la maturazione coacervata dello strato in una struttura proteica aggregata più condensata o addirittura solida porti a un contatto più stretto tra la proteina e la sonda fluorescente ad essa collegata, producendo potenzialmente un effetto di spegnimento che si manifesta in una durata ridotta della sonda (τ) , come descritto in precedenza40.,41 ,42.Inoltre, per i campioni con doppia etichetta (AF488 e Atto647N come coloranti donatori e accettori FRET, rispettivamente), questa diminuzione di τ può anche essere accompagnata dalla condensazione del coacervato e da un aumento dell'efficienza FRET(E) durante LSPT.Abbiamo monitorato la formazione di raft e spot nel tempo nei campioni LLPS αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau (25 µM di ciascuna proteina nel buffer LLPS contenente 1 µM AF488 etichettato αS e/o Atto647N etichettato Tau441 o ΔNt-Tau).Abbiamo osservato una tendenza generale secondo cui la durata della fluorescenza delle sonde AF488 (τ488) e Atto647N (τ647N) è leggermente diminuita con la maturazione dei coacervati (Fig. 6 e Figura 8c supplementare).È interessante notare che questo cambiamento è stato significativamente migliorato per i punti all'interno delle zattere (Fig. 6c), indicando che si è verificata un'ulteriore condensazione proteica nei punti.A sostegno di ciò, non è stato osservato alcun cambiamento significativo nella durata della fluorescenza per le goccioline αS / ΔNt-Tau invecchiate per 24 ore (Figura 8d supplementare), suggerendo che la gelificazione delle goccioline è un processo distinto dallo spotting e che non è accompagnato da una significativa riorganizzazione molecolare all'interno dei coacervati.Va notato che i punti hanno dimensioni diverse e contenuto variabile in αS, in particolare per il sistema αS/Tau441 (Figura 8e supplementare).La diminuzione della durata della fluorescenza spot è stata accompagnata da un aumento dell'intensità, in particolare per Tau441 marcato con Atto647N (Figura 8a supplementare) e da efficienze FRET più elevate per entrambi i sistemi αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau, indicando un'ulteriore condensazione in LLPS Cinque ore dopo l'innesco, le proteine ​​all'interno dell'elettricità statica si sono condensate.Rispetto a αS/ΔNt-Tau, abbiamo osservato valori di τ647N più bassi e τ488 leggermente più alti negli spot αS/Tau441, accompagnati da valori FRET più bassi e disomogenei.Forse, ciò può essere correlato al fatto che nel sistema αS / Tau441, l'abbondanza di αS osservata e prevista negli aggregati è più eterogenea, spesso substechiometrica rispetto a Tau, poiché Tau441 stesso può anche subire LLPS e aggregazione (Figura 8e supplementare) .Tuttavia, il grado di coalescenza delle goccioline, formazione di zattere e, soprattutto, aggregazione proteica all'interno di coacervati simili a liquidi è massimo quando sono presenti sia Tau441 che αS.
a Immagini al microscopio a fluorescenza (FLIM) a vita di αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau a 25 μM di ciascuna proteina (1 μM αS etichettato con AF488 e 1 μM Tau441 o ΔNt-Tau etichettato con Atto647N) nel buffer LLPS.Le colonne mostrano immagini rappresentative di campioni LLPS a diversi tempi di maturazione (30 minuti, 5 ore e 24 ore).La cornice rossa mostra la regione contenente spot αS/Tau441.La durata della vita è mostrata come barre colorate.Barra della scala = 20 µm per tutte le immagini.b Immagine FLIM ingrandita dell'area selezionata, mostrata nel riquadro rosso nel pannello a.Gli intervalli di vita sono mostrati utilizzando la stessa scala di colori del pannello a.Barra della scala = 5 µm.c Istogrammi che mostrano AF488 (attaccato ad αS) o Atto647N (attaccato a Tau) per diverse specie proteiche (goccioline-D-, raft-R- e speckle-P) identificate nelle immagini FLIM registrate per αS-) distribuzioni temporali durata di Tau441 e Campioni coacervati αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI per D, 29-44 ROI per R e 21-51 ROI per punti).I valori medi e mediani sono mostrati rispettivamente come quadrati gialli e linee nere all'interno dei riquadri.I limiti inferiore e superiore del riquadro rappresentano rispettivamente il primo e il terzo quartile e i valori minimo e massimo all'interno dell'intervallo interquartile (IQR) di 1,5 volte sono mostrati come baffi.I valori anomali vengono visualizzati come diamanti neri.La significatività statistica tra coppie di distribuzioni è stata determinata utilizzando un test t a due campioni, assumendo varianze disuguali.I valori p del test t a due code sono mostrati con asterischi per ciascuna coppia di dati confrontati (* valore p > 0,01, ** valore p > 0,001, *** valore p > 0,0001, **** valore p > 0,00001), ns Indica trascurabilità (valore p > 0,05).I valori p esatti sono forniti nella tabella supplementare 1 e i dati originali sono presentati come file di dati grezzi.
Per dimostrare ulteriormente la natura simile all'amiloide delle macchioline/aggregati, abbiamo trattato campioni di coacervato non colorati per 24 ore con alte concentrazioni di NaCl (1 M), che hanno portato alla separazione degli aggregati dai coacervati proteici.Quando sono stati osservati aggregati isolati (cioè una soluzione dispersa di aggregati) mediante microscopia a forza atomica (AFM), abbiamo osservato una morfologia prevalentemente sferica con un'altezza regolare di circa 15 nm, che tende ad associarsi in condizioni di elevata concentrazione salina, simile a il comportamento delle tipiche fibrille amiloidi dovute al forte effetto idrofobico sulla superficie (si noti che le fibrille hanno tipicamente un'altezza di ~ 10 nm) (Figura 10a supplementare).È interessante notare che, quando gli aggregati isolati sono stati incubati con ThT in un test di fluorescenza ThT standard, abbiamo osservato un drammatico aumento della resa quantica di fluorescenza ThT, paragonabile a quello osservato quando il colorante è stato incubato con tipiche fibrille di amiloide αS (Figura 10b supplementare), suggerendo che gli aggregati coacervati contengono strutture simili all'amiloide..In effetti, gli aggregati erano tolleranti ad elevate concentrazioni di sale ma sensibili al cloruro di guanidina 4 M (GdnHCl), come le tipiche fibrille amiloidi (Figura 10c supplementare).
Successivamente, abbiamo analizzato la composizione degli aggregati utilizzando la fluorescenza di una singola molecola, la spettroscopia di correlazione specifica di fluorescenza/correlazione incrociata (FCS/FCCS) e l'analisi burst del rilevamento di coincidenza di due colori (TCCD).A tal fine, abbiamo isolato gli aggregati formati dopo 24 ore di incubazione in campioni LLPS da 100 μl contenenti αS e Tau441 (entrambi 25 μM) insieme a 1 μM di αS marcato con AF488 e 1 μM di Tau441 marcato con Atto647N.Diluire la soluzione aggregata dispersa risultante in uno stato monomolecolare utilizzando lo stesso tampone privo di PEG e 1 M NaCl (lo stesso tampone utilizzato per separare gli aggregati dal coacervato) per prevenire eventuali interazioni elettrostatiche tra LLPS e proteine.Un esempio della traiettoria temporale di una singola molecola può essere visto in Fig. 7a.L'analisi FCCS/FCS (correlazione incrociata, CC e autocorrelazione, AC) ha mostrato che gli aggregati contenenti αS e tau erano abbondanti nei campioni (vedere curva CC in Fig. 7b, pannello di sinistra) e un eccesso di proteina monomerica residua si presentava come una risultato del processo di diluizione (vedere curve AC nella Figura 7b, pannello di sinistra).Esperimenti di controllo eseguiti nelle stesse condizioni di soluzione utilizzando campioni contenenti solo proteine ​​monomeriche non hanno mostrato curve CC e le curve AC si adattano bene al modello di diffusione monocomponente (Eq. 4), dove le proteine ​​monomeriche hanno i coefficienti di diffusione attesi (Fig. 7b ), pannello di destra).Il coefficiente di diffusione delle particelle aggregate è inferiore a 1 µm2/s e quello delle proteine ​​monomeriche è di circa 1 µm2/s.50–100 µm/s;i valori sono simili ai valori precedentemente pubblicati per le fibrille di amiloide αS sonicate e αS monomerico separatamente in condizioni di soluzione simili44.Quando abbiamo analizzato gli aggregati con l'analisi dell'esplosione TCCD (Fig. 7c, pannello superiore), abbiamo scoperto che in ciascun aggregato isolato (eteroaggregato αS/Tau), circa il 60% degli aggregati rilevati conteneva sia αS che tau, circa il 30% conteneva solo tau, solo circa il 10% di αS.L'analisi stechiometrica degli eteroaggregati αS/Tau ha mostrato che la maggior parte degli eteroaggregati erano arricchiti in tau (stechiometria inferiore a 0,5, il numero medio di molecole di tau per aggregato è 4 volte superiore alle molecole di αS), il che è coerente con il nostro lavoro osservato in FLIM in situ esperimenti..L'analisi FRET ha mostrato che questi aggregati contenevano entrambe le proteine, anche se i valori FRET effettivi in ​​questo caso non sono di grande importanza, poiché la distribuzione dei fluorofori in ciascun aggregato era casuale a causa di un eccesso di proteine ​​non marcate utilizzate nell'esperimento.È interessante notare che, quando abbiamo eseguito la stessa analisi utilizzando la variante Tau carente di aggregazione amiloide matura 45,46 (vedere Figura 11a, b supplementare), abbiamo notato che sebbene l'aggregazione elettrostatica αS fosse la stessa (Figura 11c, d supplementare), la capacità di formare aggregati all'interno del coacervato è stata drasticamente ridotta e FLIM ha rilevato diversi punti negli esperimenti in situ e sono state osservate deboli curve di correlazione incrociata per campioni aggregati isolati.Tuttavia, per un piccolo numero di aggregati rilevati (solo un decimo di Tau441), abbiamo osservato che ciascun aggregato era arricchito in αS rispetto a questa variante Tau, con circa il 50% degli aggregati rilevati contenenti solo molecole αS e αS era eterogeneo in eccesso .aggregati (vedi Figura 11e supplementare), in contrasto con gli aggregati eterogenei generati da Tau441 (Fig. 6f).I risultati di questi esperimenti hanno mostrato che sebbene αS stesso sia in grado di accumularsi con tau all'interno del coacervato, la nucleazione di tau è più favorevole in queste condizioni e gli aggregati simili amiloidi risultanti sono in grado di agire come una forma di αS e tau.Tuttavia, una volta formato un nucleo ricco di tau, le interazioni eterotipiche tra αS e tau sono favorite negli aggregati rispetto alle interazioni omotipiche tra le molecole di tau;osserviamo anche reti proteiche nei coacervati liquidi αS/tau.
a Tracce temporali di fluorescenza rappresentative di singole molecole di aggregati isolati formati in coacervati elettrostatici αS/Tau441.Burst corrispondenti a coaggregati αS/Tau441 (burst sopra la soglia indicata) sono stati osservati in tre canali di rilevamento (emissione AF488 e Atto647N dopo eccitazione diretta, linee blu e rosse, emissione Atto647N dopo eccitazione indiretta), FRET, linea viola).b Analisi FCS/FCCS di un campione di aggregati αS/Tau441 isolati ottenuti da LLPS (pannello di sinistra).Le curve di autocorrelazione (AC) per AF488 e Atto647N sono mostrate rispettivamente in blu e rosso, e le curve di correlazione incrociata (CC) associate ad aggregati contenenti entrambi i coloranti sono mostrate in viola.Le curve AC riflettono la presenza di specie proteiche monomeriche e aggregate marcate, mentre le curve CC mostrano solo la diffusione di aggregati con doppia etichetta.La stessa analisi, ma nelle stesse condizioni di soluzione dei punti isolati, i campioni contenenti solo αS monomerici e Tau441 sono mostrati come controlli nel pannello di destra.c Analisi flash di fluorescenza di singole molecole di aggregati isolati formati in coacervati elettrostatici αS/Tau441.Le informazioni per ciascun aggregato trovato in quattro diverse ripetizioni (N = 152) vengono tracciate rispetto alla loro stechiometria, ai valori S e all'efficienza FRET (pannello superiore, la barra dei colori riflette l'occorrenza).Si possono distinguere tre tipi di aggregati: aggregati -αS solo con S~1 e FRET~0, aggregati solo Tau con S~0 e FRET~1 e aggregati Tau/αS eterogenei con S e FRET intermedi Stime dell'importo di entrambe le proteine ​​marcatrici rilevate in ciascun aggregato eterogeneo (N = 100) sono mostrate nel pannello inferiore (la scala dei colori riflette l'occorrenza).I dati grezzi vengono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
È stato segnalato che la maturazione o l'invecchiamento dei condensati proteici liquidi in strutture gelatinose o solide nel tempo è coinvolta in diverse funzioni fisiologiche del condensato47 così come nelle malattie, come processo anomalo che precede l'aggregazione dell'amiloide7, 48, 49. Qui studiamo in dettaglio la separazione delle fasi e il comportamento.LSPT αS in presenza di policationi casuali in un ambiente controllato a basse concentrazioni micromolari e condizioni fisiologicamente rilevanti (si noti che la concentrazione fisiologica calcolata di αS è> 1 µM50), seguendo il tipico comportamento termodinamico guidato di LPS.Abbiamo scoperto che αS, che contiene una regione C-terminale altamente caricata negativamente a pH fisiologico, è in grado di formare goccioline ricche di proteine ​​in soluzione acquosa tramite LLPS in presenza di peptidi disordinati altamente cationici come pLK o Tau attraverso il processo di elettrostatica condensazione complessa in presenza di macromolecole di aggregazione.Questo processo può avere effetti rilevanti nell'ambiente cellulare dove αS incontra varie molecole policationiche associate alla sua aggregazione associata alla malattia sia in vitro che in vivo51,52,53,54.
In molti studi, la dinamica delle proteine ​​all'interno delle goccioline è stata considerata come uno dei fattori chiave che determinano il processo di maturazione55,56.Negli αS elettrostatici coacervati con policationi, il processo di maturazione dipende apparentemente dalla forza delle interazioni con i policationi, dalla valenza e dalla molteplicità di queste interazioni.La teoria dell'equilibrio suggerisce che un paesaggio di equilibrio di due stati liquidi sarebbe la presenza di una grande goccia ricca di biopolimeri che guidano l'LLPS57,58.La crescita delle goccioline può essere ottenuta mediante maturazione Ostwald59, coalescenza60 o consumo di monomero libero nella fase dispersa61.Per αS e Tau441, ΔNt-Tau o pLK, la maggior parte della proteina era concentrata nel condensato nelle condizioni utilizzate in questo studio.Tuttavia, mentre le goccioline di tau a grandezza naturale si coalizzavano rapidamente dopo la bagnatura della superficie, la coalescenza e la bagnatura delle goccioline erano difficili per ΔNt-Tau e pLK, suggerendo una rapida perdita di proprietà del liquido in questi due sistemi.Secondo la nostra analisi FLIM-FRET, le goccioline pLK e ΔNt-Tau invecchiate hanno mostrato un grado simile di aggregazione proteica (durata della fluorescenza simile) come le goccioline originali, suggerendo che la rete proteica originale è stata mantenuta, anche se più rigida.
Razionalizziamo i nostri risultati sperimentali nel seguente modello (Figura 8).Le goccioline inizialmente formate temporaneamente sono spesso reti proteiche senza compensazione elettrostatica, e quindi ci sono aree di squilibrio di carica, specialmente all'interfaccia delle goccioline, che danno luogo a goccioline con un elevato potenziale elettrostatico superficiale.Per compensare la carica (un fenomeno comunemente indicato come svuotamento di valenza) e ridurre al minimo il potenziale superficiale delle goccioline, le goccioline possono includere nuovi polipeptidi dalla fase diluita, riorganizzare le reti proteiche per ottimizzare le interazioni carica-carica e interagire con altre goccioline.con superfici (bagnatura).Le goccioline αS/pLK, a causa della loro rete proteica più semplice (solo interazioni eterotipiche tra αS e pLK) e maggiore affinità per le interazioni proteina-proteina, sembrano essere in grado di bilanciare più rapidamente la carica del condensato;infatti, abbiamo osservato una cinetica proteica più rapida nei coacervati αS/pLK inizialmente formati rispetto a αS/Tau.Dopo l'esaurimento della valenza, le interazioni diventano meno effimere e le goccioline perdono le loro proprietà liquide e si trasformano in goccioline gelatinose, non infiammabili con un basso potenziale elettrostatico superficiale (e quindi incapaci di bagnare la superficie).Al contrario, le goccioline αS/Tau sono meno efficienti nell’ottimizzare il bilancio di carica delle goccioline a causa di reti proteiche più complesse (con interazioni sia omotipiche che eterotipiche) e della natura più debole delle interazioni proteiche.Ciò si traduce in goccioline che mantengono il comportamento liquido per lunghi periodi di tempo e mostrano un elevato potenziale elettrostatico superficiale che tende a essere minimizzato dalla coalescenza e dalla crescita (minimizzando così il rapporto area superficiale/volume delle goccioline) e bagnando la superficie idrofila.Ciò crea grandi librerie proteiche concentrate che mantengono le proprietà fluide poiché le interazioni rimangono molto transitorie a causa della costante ricerca di ottimizzazione della carica nella rete proteica.È interessante notare che le forme troncate N-terminale di Tau, comprese alcune isoforme presenti in natura62, mostrano un comportamento intermedio, con alcuni coacervati che invecchiano con αS in goccioline simili a gel a lunga vita, mentre altri si trasformano in grandi condensati liquidi.Questa dualità nella maturazione dei coacervati elettrostatici αS è coerente con i recenti studi teorici e sperimentali LLPS che hanno identificato una correlazione tra l'esaurimento della valenza e la setacciatura elettrostatica nei condensati come chiave per controllare le dimensioni del condensato e le proprietà del fluido.Meccanismo 58.61.
Questo schema mostra il presunto percorso di aggregazione dell'amiloide per αS e Tau441 tramite LLPS e LSPT.Con ulteriori regioni ricche di anioni (rosso) e ricche di cationi (blu), i coacervati elettrostatici αS e tau con valenza soddisfacente hanno un'energia superficiale inferiore e quindi una minore coalescenza, con conseguente rapido invecchiamento delle goccioline.Si ottiene uno stato di gel stabile non agglomerato..Questa situazione è molto favorevole nel caso del sistema αS/pLK grazie alla sua maggiore affinità e alla più semplice rete di interazione delle coppie di proteine, che consente una rapida transizione simile a un gel.Al contrario, goccioline con valenza insoddisfacente e, quindi, regioni cariche di proteine ​​disponibili per l'interazione, rendono più facile per il coacervato fondersi e bagnare la superficie idrofila al fine di ridurre la sua elevata energia superficiale.Questa situazione è preferibile per i coacervati αS/Tau441, che hanno una rete complessa multivalente costituita da deboli interazioni Tau-Tau e αS-Tau.A loro volta, i coacervati più grandi manterranno più facilmente le loro proprietà simili a fluidi, consentendo il verificarsi di altre interazioni proteina-proteina.Alla fine, all'interno del fluido coacervato si formano aggregati eterogenei di amiloide contenenti sia αS che tau, che possono essere correlati a quelli trovati nei corpi inclusi, che sono segni distintivi delle malattie neurodegenerative.
Le grandi strutture fluide formate durante la maturazione di αS/Tau441 con un ambiente proteico altamente congestionato ma dinamico e, in misura minore, i coacervati αS/ΔNt-Tau sono serbatoi ideali per la nucleazione dell'aggregazione proteica.Abbiamo infatti osservato la formazione di aggregati proteici solidi in questo tipo di coacervati proteici, spesso contenenti sia αS che tau.Abbiamo dimostrato che questi eteroaggregati sono stabilizzati da interazioni non elettrostatiche, sono in grado di legare coloranti ThT specifici per l'amiloide allo stesso modo delle tipiche fibrille amiloidi e in effetti hanno una resistenza simile a varie influenze.È stato dimostrato che gli aggregati αS/tau formati da LLPS hanno proprietà simili all'amiloide.Infatti, la variante matura di Tau carente nell'aggregazione amiloide è significativamente compromessa nella formazione di questi aggregati αS eterogenei all'interno del coacervato elettrostatico liquido.La formazione di aggregati αS/Tau441 è stata osservata solo all'interno dei coacervati, che conservavano proprietà liquide, e mai, se i coacervati/goccioline non raggiungevano lo stato di gel.In quest'ultimo caso, la maggiore forza delle interazioni elettrostatiche e, di conseguenza, la rigidità della rete proteica impediscono i necessari riarrangiamenti conformazionali delle proteine ​​per stabilire nuove interazioni proteiche necessarie per la nucleazione dell'amiloide.Tuttavia, ciò può essere ottenuto in coacervati più flessibili, simili a liquidi, che a loro volta hanno maggiori probabilità di rimanere liquidi man mano che aumentano di dimensioni.
Il fatto che la formazione di aggregati all’interno della fase condensata sia preferibile nei grandi condensati αS/Tau rispetto alle piccole goccioline che gelificano rapidamente, evidenzia l’importanza di identificare i fattori che controllano la coalescenza delle goccioline.Pertanto, non solo esiste una tendenza alla separazione di fase, ma la dimensione della condensa deve essere controllata per il corretto funzionamento e per la prevenzione delle malattie58,61.I nostri risultati evidenziano anche l’importanza dell’equilibrio tra LLPS e LSPT per il sistema αS/Tau.Mentre la formazione di goccioline può proteggere dall'aggregazione amiloide riducendo la quantità di monomeri proteici disponibili in condizioni di saturazione, come è stato proposto in altri sistemi63,64, la fusione di goccioline ad alti livelli di goccioline può portare all'aggregazione proteica interna attraverso lenti riarrangiamenti conformazionali.reti proteiche..
Nel complesso, i nostri dati sottolineano fortemente la rilevanza della valenza coesiva e delle interazioni soddisfatto/insoddisfatto nelle reti di caduta nel contesto dell'LSPT.In particolare, mostriamo che i condensati αS/Tau441 a lunghezza intera sono in grado di fondersi e nucleare in modo efficiente per formare eteroaggregati simili all'amiloide che includono entrambe le proteine ​​e proponiamo un meccanismo molecolare basato sui nostri risultati sperimentali.La co-aggregazione di due proteine ​​nel coacervato del fluido αS/Tau che riportiamo qui potrebbe infatti essere correlata alla co-localizzazione di due proteine ​​nelle inclusioni, che sono segni distintivi della malattia, e potrebbe contribuire a comprendere la relazione tra LLPS e aggregazione amiloide, aprendo la strada all’IDP altamente carico nella neurodegenerazione.
WT-αS monomerico, mutanti di cisteina (Q24C-αS, N122C-αS) e varianti ΔCt-αS (Δ101-140) sono stati espressi in E. coli e purificati come precedentemente descritto.5 mM DTT è stato incluso in tutte le fasi della purificazione dei mutanti della cisteina αS per prevenire la formazione di legami disolfuro.Sono state coltivate colture di E. coli con l'isoforma Tau441 (plasmide ottenuto da Addgene #16316), variante ΔNt-Tau (Δ1–150, ottenuta clonando IVA con primer CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) e variante AggDef-Tau (Δ275–311, purificata con primer GGCTC5). cresciuto a OD600 = 0,6–0,7 a 37°C e 180 giri/min, e l'espressione è stata indotta con IPTG per 3 ore a 37°C.Raccogliere le cellule a 11.500 xg per 15 minuti a 4 gradi centigradi e lavarle con tampone salino contenente 150 mM NaCl.Risospendere il pellet in tampone di lisi (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, copeptina 100 μM).La fase di sonicazione è stata eseguita su ghiaccio con un'ampiezza dell'80% per 10 impulsi (1 minuto acceso, 1 minuto spento).Non superare i 60 ml in un'ecografia.I lisati di E. coli sono stati riscaldati a 95°C per 20 minuti, quindi raffreddati su ghiaccio e centrifugati a 127.000 x g per 40 minuti.Il surnatante chiarificato è stato applicato su una membrana da 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) e dializzato contro 4 L di tampone di dialisi (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) per 10 ore.Una colonna a scambio cationico da 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) è stata equilibrata con tampone di equilibrazione (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Il lisato di tau è stato filtrato attraverso un filtro PVDF da 0,22 μm e iniettato nella colonna ad una portata di 1 ml/min.L'eluizione è stata effettuata gradualmente, tau è stata eluita con tampone di eluizione al 15-30% (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Le frazioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE e tutte le frazioni contenenti una banda con il peso molecolare previsto di tau sono state concentrate utilizzando un filtro centrifugo da 10 kDa e sostituite con un tampone contenente HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e DTT 2 mM per la concentrazione proteica finale era di 100 μM.La soluzione proteica è stata quindi fatta passare attraverso un filtro in PVDF da 0,22 μm, congelata rapidamente e conservata a -80°C.La proteina K18 è stata gentilmente fornita dal Prof. Alberto Boffi.La purezza della preparazione era >95% come confermato da SDS-PAGE e MALDI-TOF/TOF.Varie cisteine ​​sono state etichettate chimicamente con AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) o TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).sono stati confermati dall'assorbanza e dal MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau e K18 sono stati etichettati con residui di cisteina nativa nelle posizioni 191 e 322 utilizzando Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germania) seguendo la stessa procedura.Le mappe della carica netta per residuo per αS e Tau441 sono state generate utilizzando CIDER66.
La poli-L-lisina solida (pLK DP 90-110 secondo NMR del fornitore, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) è stata sciolta in HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, concentrazione pH da 7,4 a 10 mM, processo sonicato per 5 minuti in un bagnomaria a ultrasuoni e conservare a -20°C.PEG-8, destrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) e FITC-destrano-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) sono solubili in acqua e ampiamente distribuiti nel tampone LLPS.La dialisi rimuove i sali contaminanti.Sono stati quindi filtrati attraverso un filtro a siringa con una dimensione dei pori di 0,22 μm e la loro concentrazione è stata calcolata utilizzando un rifrattometro (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).I campioni LLPS sono stati preparati a temperatura ambiente nel seguente ordine: tampone ed estrusione sono stati miscelati e 1 mM di tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM di 2,2,2,2-(Etano- acido 1,2-diildinitrile) tetraacetico (EDTA, carbossinte) e una miscela di inibitore della proteasi all'1% (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptina 5 μM).Quindi vengono aggiunti αS e policationi fusi (opzioni pLK o Tau).Per gli esperimenti sulle serie temporali di tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Regno Unito), utilizzare la concentrazione totale di ThT in modo che sia la metà della concentrazione di αS.Mescolare delicatamente ma accuratamente i campioni per garantire che siano omogenei.La concentrazione di ciascun componente variava da esperimento a esperimento, come descritto nella sezione Risultati.L'azide è stata utilizzata ad una concentrazione dello 0,02% (p/v) ogni volta che la durata dell'esperimento superava le 4 ore.Per tutte le analisi che utilizzano campioni LLPS, lasciare equilibrare la miscela per 5 minuti prima dell'analisi.Per l'analisi della diffusione della luce, 150 µl di campioni sono stati caricati su micropiastre da 96 pozzetti non leganti (μClear®, nera, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) e ricoperti con pellicola adesiva.Gli LLP sono stati monitorati misurando l'assorbanza a 350 nm al centro della soluzione in un lettore di piastre CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germania).Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato a 25°C e gli errori sono stati calcolati come deviazione standard dalla media.La fase diluita è stata quantificata mediante centrifugazione del campione e analisi del gel SDS-PAGE, e la frazione αS nelle fasi diluita e concentrata è stata quantificata in varie soluzioni LLPS.Un campione LLPS da 100 μl contenente αS marcato con AF488 da 1 μM è stato preparato mediante miscelazione accurata seguita da centrifugazione a 9600 × g per 30 minuti, dopo di che il precipitato era solitamente visibile.I primi 50 μl del surnatante sono stati utilizzati per la quantificazione delle proteine ​​utilizzando il gel SDS-PAGE.I gel sono stati scansionati con filtri AF488 utilizzando un sistema di imaging gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) o colorati con colorazione Coomassie e visualizzati con filtri appropriati.Le bande risultanti sono state analizzate utilizzando ImageJ versione 1.53i (National Institutes of Health, USA).Gli esperimenti sono stati condotti in duplicato in due diversi esperimenti con risultati simili.
In genere, 150 μl di campioni sono stati applicati su micropiastre da 96 pozzetti non leganti e visualizzati a temperatura ambiente su un microscopio invertito Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).Per gli esperimenti spot sono state utilizzate anche piastre µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) o micropiastre in polistirene a 96 pozzetti (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Come sorgenti di illuminazione sono state utilizzate lampade alogene EL6000 o ad alogenuri metallici al mercurio (rispettivamente per l'imaging BF/DIC e WF).Per la microscopia WF, è stato utilizzato un obiettivo ad aria con ingrandimento 40x (Leica Microsystems, Germania) per focalizzare la luce sul campione e raccoglierlo.Per i campioni etichettati AF488 e ThT, filtrare l'eccitazione e l'emissione con set di filtri GFP standard, filtri passa-banda di eccitazione ed emissione, rispettivamente, filtri passa-banda da 460–500 nm e 512–542 nm e uno specchio dicroico da 495 nm.Per i campioni etichettati con Atto647N, sono stati utilizzati un set standard di filtri Cy5 con filtri passa-banda di eccitazione ed emissione rispettivamente da 628–40 nm e 692–40 nm e uno specchio dicroico da 660 nm.Per la microscopia BF e DIC, utilizzare lo stesso obiettivo di raccolta della luce riflessa.La luce raccolta è stata registrata su una fotocamera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Germania).Il tempo di esposizione era di 50 ms per l'imaging al microscopio BF e DIC e di 20-100 ms per l'imaging al microscopio WF.Per fare un confronto, il tempo di esposizione per tutti gli esperimenti con ThT è stato di 100 ms.Sono stati eseguiti esperimenti time-lapse per visualizzare la coalescenza delle goccioline, raccogliendo immagini ogni 100 ms per diversi minuti.ImageJ (NIH, USA) è stato utilizzato per l'analisi delle immagini.Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con risultati simili.
Per gli esperimenti di colocalizzazione, FRAP e ricostruzione 3D, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale invertito Zeiss LSM 880 utilizzando un'edizione blu ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).Campioni da 50 µl sono stati applicati su piastre Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germania), trattati con un polimero idrofilo (ibiTreat) e montati in un obiettivo a immersione in olio 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) sul DIC).Le immagini sono state acquisite utilizzando linee laser argon da 458 nm, 488 nm e 633 nm con una risoluzione di 0,26 µm/pixel e un tempo di esposizione di 8 µs/pixel per finestre di rilevamento di eccitazione ed emissione di 470–600 nm, 493–628 nm, e 638–755 nm sono stati utilizzati per visualizzare rispettivamente ThT, AF488 e Atto647N.Per gli esperimenti FRAP, la fotografia time-lapse di ciascun campione è stata registrata a 1 fotogramma al secondo.Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato a temperatura ambiente con risultati simili.Tutte le immagini sono state analizzate utilizzando il software Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).Le curve FRAP sono state normalizzate, tracciate e adattate ai dati di intensità/tempo estratti dalle immagini utilizzando Zen 2 utilizzando OriginPro 9.1.Le curve di recupero sono state adattate a un modello monoesponenziale per tenere conto della diffusione molecolare con un termine esponenziale aggiuntivo per tenere conto dell'effetto sbiancante dell'acquisizione.Abbiamo quindi calcolato D utilizzando il raggio di sbiancamento nominale e l'emivita di recupero precedentemente determinata come nell'equazione di Kang et al.5 35 mostrato.
Varianti di αS a cisteina singola sono state sintetizzate con 4-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-ossile (TEMPOL) nelle posizioni 24 (TEMPOL-24-αS) e 122 (TEMPOL-122-αS), rispettivamente.Etichettatura con spin Per gli esperimenti EPR, la concentrazione di αS è stata fissata a 100 μM e la concentrazione di PEG era al 15% (p/v).Per varie condizioni di aggregazione, il rapporto αS:pLK era 1:10, mentre i rapporti αS:ΔNt-Tau e αS:Tau441 sono stati mantenuti a 1:1.Per gli esperimenti di titolazione vincolante in assenza di affollamento, TEMPOL-122-αS è stato mantenuto a 50 μM e i policationi sono stati titolati a concentrazioni crescenti, preparando ciascuna condizione separatamente.Le misurazioni CW-EPR sono state effettuate utilizzando uno spettrometro in banda X Bruker ELEXSYS E580 dotato di un risonatore Bruker ER4118 SPT-N1 funzionante a una frequenza di microonde (SHF) di ~ 9,7 GHz.La temperatura è stata fissata a 25°C e controllata da un criostato ad azoto liquido.Gli spettri sono stati ottenuti in condizioni insature con una potenza MW di 4 mW, un'ampiezza di modulazione di 0,1 mT e una frequenza di modulazione di 100 kHz.Le intensità spettrali sono state normalizzate per evitare differenze nelle concentrazioni di spin tra i campioni e una possibile riduzione dello spin dovuta a concentrazioni residue di agenti riducenti nei campioni contenenti Tau441 o ΔNt-Tau (presente nelle soluzioni proteiche originali).I valori indicati di g sono stati ottenuti come risultato della modellazione spettrale EPR eseguita utilizzando il software Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementato in Matlab®67.Per modellare i dati sono stati utilizzati modelli isotropi a uno/due componenti.Dopo aver normalizzato tutti i segnali, i residui sono stati calcolati sottraendo ciascuna simulazione dal corrispondente spettro sperimentale.Per l'analisi della titolazione del legame, è stata utilizzata l'intensità relativa della terza banda rispetto alla seconda banda dello spettro EPR normalizzato (IIII/III) per monitorare il legame dei policationi ad αS.Per stimare la costante di dissociazione (Kd), la curva risultante è stata adattata a un modello approssimativo assumendo n siti di legame identici e indipendenti.
Gli esperimenti di spettroscopia NMR sono stati condotti utilizzando uno spettrometro NMR Bruker Neo da 800 MHz (1H) dotato di criosonda e gradiente Z.Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando 130–207 µM αS e corrispondenti equivalenti αS/ΔNt-Tau e pLK in HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, DO 10%, pH 7,4 e sono stati eseguiti a 15°C.Per monitorare l'LPS mediante NMR, ai campioni premiscelati è stato aggiunto il 10% di PEG.Il grafico delle perturbazioni dello spostamento chimico (Fig. 1b) mostra gli spostamenti chimici medi di 1H e 15N.Gli spettri αS 2D1H-15N HSQC sono stati assegnati in base a un'assegnazione precedente (voce BMRB n. 25227) e confermati registrando e analizzando gli spettri 3D di HNCA, HNCO e CBCAcoNH.Gli spostamenti chimici 13Cα e 13Cβ sono stati calcolati in presenza di ΔNt-Tau o pLK per misurare i possibili cambiamenti nelle tendenze della struttura secondaria rispetto agli spostamenti chimici αS nella conformazione pura della bobina casuale 68 (Figura 5c supplementare).Le frequenze R1ρ sono state misurate registrando esperimenti hsqctretf3gpsi (ottenuti dalla libreria Bruker) con ritardi di 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 e 800 ms, e le funzioni esponenziali sono state adattate ai ritardi di intensità di picco a diversi tempi per determinare R1ρ e la sua incertezza sperimentale.
Esperimenti di microscopia a fluorescenza a fluorescenza a due colori risolti nel tempo sono stati eseguiti su un microscopio confocale a fluorescenza MT200 commerciale a risoluzione temporale (PicoQuant, Berlino, Germania) con un dispositivo TSCPC (Counting Single Photon Counting) correlato nel tempo.La testa del diodo laser viene utilizzata per l'eccitazione interleaved pulsata (PIE), il raggio passa attraverso una guida d'onda monomodale ed è sintonizzato su una potenza laser compresa tra 10 e 100 nW per linee laser da 481 nm e 637 nm misurate dopo uno specchio dicroico.Ciò garantisce una velocità di conteggio dei fotoni ottimale, evitando gli effetti di aliasing, fotosbiancamento e saturazione dei fotoni.Vetrini o piastre per angiogenesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) sono stati posizionati direttamente in acqua di immersione su una lente Super Apochromat 60x NA 1.2 con un collare correttivo (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Come divisore del fascio principale è stato utilizzato uno specchio dicroico da 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA).La radiazione non focalizzata viene bloccata da un foro del diametro di 50 micron, quindi la radiazione focalizzata viene divisa in 2 percorsi di rilevamento da un divisore di raggio 50/50.Davanti al rilevatore sono stati utilizzati filtri di emissione passa-banda (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 per il colorante verde (AF488) e 690/70 per il colorante rosso (Atto647N).Come rilevatori sono stati utilizzati diodi a valanga a fotone singolo (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia).Sia la raccolta che l'analisi dei dati sono state eseguite utilizzando il software SymphoTime64 disponibile in commercio (PicoQuant GmbH, Berlino, Germania).
Cinquanta microlitri di campioni LLPS sono stati applicati ai pozzetti di angiogenesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania).Le immagini risultanti vengono focalizzate a 20 µm sopra il fondo del pozzo per una distanza di lavoro obiettiva ottimale per le goccioline sospese e a ~1 µm per raft e punti con una risoluzione assiale di almeno 0,25 µm/pixel e un tempo di ritardo di 400 µs/pixel.Selezionare i dati applicando una soglia di intensità basata sull'intensità media del segnale di fondo (PBG, media + 2σ) per ciascun canale in modo che vengano selezionate solo goccioline, zattere o punti di proteine ​​liquide, filtrando ogni possibile origine dalla fase dispersa.Per analizzare la durata della vita di ciascuna specie (τ) di ciascun canale (verde, "g" per AF488 e rosso, "r" per Atto647N), abbiamo selezionato regioni di interesse (ROI) contenenti goccioline, zattere o punti (Figura complementare 1 ).8b) e li ha derivati ​​adattando il loro decadimento della vita (τD, τR e τP per goccioline, zattere o punti, rispettivamente, vedere la Figura 8c supplementare) in ciascun canale utilizzando un'analisi di adattamento della coda e un modello di decadimento a due componenti.τ medio da τ .Le ROI che hanno prodotto un numero di fotoni troppo basso per un adattamento multiesponenziale sono state escluse dall'analisi.Il limite utilizzato era <104 fotoni per zattere e punti e 103 per gocce.Le goccioline hanno una soglia più bassa perché è difficile ottenere curve di decadimento con valori di intensità più elevati, poiché le goccioline nel campo immagine sono solitamente più piccole e meno numerose.Anche le ROI con conteggi di fotoni superiori al limite di accumulo di fotoni (impostato su >500 conteggi/pixel) sono state scartate per l'analisi.Far corrispondere la curva di decadimento dell'intensità ottenuta dalla regione di interesse con un'intensità al 90% del massimo (poco dopo l'intensità massima del decadimento) dall'inizio della vita utile per garantire un'interferenza IRF minima mantenendo la stessa per tutto il decadimento dell'intensità impostazioni Finestra temporale relativa Sono state analizzate da 25 a 50 ROI per zattere e spot e da 15 a 25 ROI per gocce, immagini selezionate da più di 4 repliche registrate da almeno 3 esperimenti indipendenti.I t-test a due code sono stati utilizzati per valutare le differenze statistiche tra specie o tra sistemi coacervati.Per un'analisi pixel per pixel della durata (τ), è stata calcolata l'attenuazione totale della durata sul campo per ciascun canale ed è stata effettuata un'approssimazione di un modello di attenuazione esponenziale a 2/3 componenti.L'attenuazione della durata per ciascun pixel è stata quindi adattata utilizzando valori τ calcolati in precedenza, risultando in un'immagine di adattamento FLIM pseudocolore.L'intervallo di durata dell'adattamento della coda era lo stesso in tutte le immagini dello stesso canale e ogni decadimento produceva abbastanza fotoni per fornire un adattamento affidabile.Per l'analisi FRET, i pixel sono stati selezionati applicando una soglia di intensità inferiore di 100 fotoni, che corrispondeva ad una media di un segnale di fondo (FBG) di 11 fotoni.L'intensità della fluorescenza di ciascun canale è stata corretta mediante fattori di correzione determinati sperimentalmente: 69 diafonia spettrale α era 0,004, l'eccitazione diretta β era 0,0305, l'efficienza di rilevamento γ era 0,517.L'efficienza FRET a livello di pixel viene quindi calcolata utilizzando la seguente equazione:
dove FDD è l'intensità di fluorescenza osservata nel canale donatore (verde), FDA è l'intensità di fluorescenza osservata nel canale accettore (rosso) sotto eccitazione indiretta e FAA è l'intensità di fluorescenza osservata nel canale accettore (rosso) sotto eccitazione diretta ( TORTA).Nel canale si osservano impulsi di intensità di fluorescenza).
Collocare 100 µl di soluzioni di reazione LLPS contenenti 25 µM di Tau441 monomerico senza etichetta (con o senza 25 µM αS) nel tampone LLPS (integrato come sopra) su micropiastre a 96 pozzetti non leganti con rivestimento in foglio adesivo e la formazione di goccioline è stata controllata mediante microscopia WF dopo equilibrazione.entro 10 minutiDopo 48 ore di incubazione a temperatura ambiente, è stata confermata la presenza di rafts e spot proteici.Quindi rimuovere con attenzione il liquido sopra le zattere dai pozzetti, quindi aggiungere 50 L di tampone di dissociazione (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, DTT 1 mM) e incubare per 10 minuti.L'elevata concentrazione di sale garantisce che LLPS non si ripeta a causa del PEG residuo e che eventuali gruppi proteici formati solo da interazioni elettrostatiche verranno disassemblati.Il fondo del pozzetto è stato poi accuratamente raschiato con la punta di una micropipetta e la soluzione risultante è stata trasferita in un pozzetto di osservazione vuoto.Dopo l'incubazione dei campioni con 50 μM di ThT per 1 ora, la presenza di macchie isolate è stata verificata mediante microscopia WF.Preparare le fibrille αS sonicate incubando 300 ml di una soluzione αS da 70 µM in PBS con pH 7,4, sodio azide 0,01% a 37 ° C e 200 giri al minuto su un agitatore orbitale per 7 giorni.La soluzione è stata quindi centrifugata a 9600×g per 30 minuti, il pellet è stato risospeso in PBS a pH 7,4 e i campioni di fibrille sono stati sonicati (1 minuto, ciclo 50%, ampiezza 80% in un sonicatore Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA). con una distribuzione dimensionale relativamente uniforme di piccole fibrille.
L'analisi FCS/FCCS e il rilevamento delle coincidenze a due colori (TCCD) sono stati eseguiti sullo stesso microscopio confocale fluorescente a risoluzione temporale MT200 (Pico-Quant, Berlino, Germania) utilizzato per gli esperimenti di microscopia FLIM-FRET utilizzando la modalità PIE.La potenza del laser per questi esperimenti è stata aggiunta a 6,0 µW (481 nm) e 6,2 µW (637 nm).La combinazione di queste potenze laser è stata scelta per produrre una luminosità simile per le coppie di fluorofori utilizzate ottenendo velocità di conteggio ottimali ed evitando fotosbiancamento e saturazione.Sia la raccolta che l'analisi dei dati sono state eseguite utilizzando il software SymphoTime64 versione 2.3 disponibile in commercio (PicoQuant, Berlino, Germania).
I campioni di aggregati αS/Tau isolati ottenuti utilizzando LLPS vengono diluiti nel tampone di isolamento alla concentrazione monomolecolare appropriata (tipicamente una diluizione 1:500, poiché gli aggregati sono già a basse concentrazioni quando isolati da campioni coacervati).I campioni sono stati applicati direttamente su vetrini coprioggetto (Corning, USA) prerivestiti con una soluzione BSA ad una concentrazione di 1 mg/mL.
Per l'analisi PIE-smFRET nei canali verde e rosso, è stata applicata una soglia di intensità inferiore di 25 fotoni per filtrare i segnali a bassa intensità causati da eventi monomerici (si noti che i monomeri sono più numerosi dei campioni aggregati rispetto agli aggregati isolati).Questa soglia è stata calcolata come cinque volte l'intensità media dell'αS monomerico ottenuto dall'analisi di campioni di monomeri puri al fine di selezionare specificamente gli aggregati per l'analisi.Il circuito di pilotaggio PIE, insieme all'acquisizione dati TSCPC, ha consentito l'applicazione di un filtro di ponderazione a vita che aiuta a eliminare la diafonia di fondo e spettrale.L'intensità del chiarore selezionata utilizzando le soglie di cui sopra è stata corretta utilizzando il segnale di fondo medio determinato dagli istogrammi di occorrenza rispetto all'intensità/bin dei campioni di solo buffer.I burst associati ad aggregati di grandi dimensioni occupano in genere diversi bin consecutivi nella traccia temporale (impostata su 1 ms).In questi casi è stato scelto un contenitore di massima robustezza.Per l'analisi FRET e stechiometrica è stato utilizzato il fattore gamma γ (0,517) determinato teoricamente.La diafonia spettrale e i contributi di eccitazione diretta sono trascurabili (determinati sperimentalmente) alla potenza del laser di eccitazione utilizzata.L'efficienza e la stechiometria del FRET in un'esplosione vengono calcolate come segue.