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317 Fornitori di tubi a spirale in acciaio inossidabile

Tabella della composizione chimica del materiale in acciaio inossidabile

SPACA6 è una proteina di superficie espressa dagli spermatozoi che è fondamentale per la fusione dei gameti durante la riproduzione sessuale dei mammiferi.Nonostante questo ruolo fondamentale, la funzione specifica di SPACA6 è poco compresa.Chiariamo la struttura cristallina del dominio extracellulare di SPACA6 con una risoluzione di 2,2 Å, rivelando una proteina a due domini composta da un fascio a quattro filamenti e sandwich β simili a Ig uniti da linker quasi flessibili.Questa struttura assomiglia a IZUMO1, un'altra proteina associata alla fusione dei gameti, rendendo SPACA6 e IZUMO1 membri fondatori della superfamiglia delle proteine ​​associate alla fecondazione, qui denominata superfamiglia IST.La superfamiglia IST è strutturalmente definita dal suo fascio contorto a quattro eliche e da una coppia di motivi CXXC collegati con disolfuro.Una ricerca AlphaFold basata sulla struttura del proteoma umano ha identificato ulteriori membri proteici di questa superfamiglia;in particolare, molte di queste proteine ​​sono coinvolte nella fusione dei gameti.La struttura SPACA6 e la sua relazione con gli altri membri della superfamiglia IST forniscono l'anello mancante nella nostra conoscenza della fusione dei gameti dei mammiferi.
Ogni vita umana inizia con due gameti aploidi separati: lo sperma del padre e l'ovulo della madre.Questo sperma è il vincitore di un intenso processo di selezione durante il quale milioni di spermatozoi attraversano il tratto genitale femminile, superano vari ostacoli1 e subiscono la capacitazione, che migliora la loro motilità e il processo dei componenti superficiali2,3,4.Anche se lo sperma e l’ovocita si ritrovano, il processo non è ancora finito.L'ovocita è circondato da uno strato di cellule cumuliformi e da una barriera glicoproteica chiamata zona pellucida, attraverso la quale devono passare gli spermatozoi per entrare nell'ovocita.Gli spermatozoi utilizzano una combinazione di molecole di adesione superficiale ed enzimi associati e secreti dalla membrana per superare queste barriere finali5.Queste molecole ed enzimi sono immagazzinati principalmente nella membrana interna e nella matrice acrosomiale e vengono rilevati quando la membrana esterna dello sperma viene lisata durante la reazione acrosomiale6.La tappa finale di questo intenso viaggio è l'evento della fusione spermatozoo-uovo, in cui le due cellule fondono le loro membrane per diventare un unico organismo diploide7.Sebbene questo processo sia rivoluzionario nella riproduzione umana, le necessarie interazioni molecolari sono poco conosciute.
Oltre alla fecondazione dei gameti, è stata ampiamente studiata la chimica della fusione di due doppi strati lipidici.In generale, la fusione delle membrane è un processo energeticamente sfavorevole che richiede che un catalizzatore proteico subisca un cambiamento di conformazione strutturale che avvicina due membrane, rompendone la continuità e provocando la fusione8,9.Questi catalizzatori proteici sono noti come fusogeni e sono stati trovati in innumerevoli sistemi di fusione.Sono necessari per l'ingresso virale nelle cellule ospiti (ad esempio, gp160 nell'HIV-1, picco nei coronavirus, emoagglutinina nei virus influenzali)10,11,12 placentare (sincitina)13,14,15 e fusioni che formano gameti negli eucarioti inferiori ( HAP2/GCS1 in piante, protisti e artropodi) 16,17,18,19.I fusogeni per i gameti umani devono ancora essere scoperti, anche se è stato dimostrato che diverse proteine ​​sono fondamentali per l'attaccamento e la fusione dei gameti.Il CD9 espresso dall'ovocita, una proteina transmembrana necessaria per la fusione dei gameti umani e murini, è stato il primo ad essere scoperto21,22,23.Sebbene la sua precisa funzione rimanga poco chiara, sembra probabile un ruolo nell'adesione, nella struttura dei foci di adesione sui microvilli dell'uovo e/o nella corretta localizzazione delle proteine ​​sulla superficie dell'ovocita24,25,26.Le due proteine ​​più tipiche che sono fondamentali per la fusione dei gameti sono la proteina spermatica IZUMO127 e la proteina ovocitaria JUNO28, e la loro mutua associazione è un passo importante nel riconoscimento e nell'adesione dei gameti prima della fusione.I topi knockout maschi Izumo1 e i topi knockout Juno femmine sono completamente sterili, in questi modelli gli spermatozoi entrano nello spazio perivitellino ma i gameti non si fondono.Allo stesso modo, la confluenza veniva ridotta quando i gameti venivano trattati con anticorpi anti-IZUMO1 o JUNO27,29 negli esperimenti di fecondazione umana in vitro.
Recentemente è stato scoperto un gruppo di proteine ​​espresse dagli spermatozoi fenotipicamente simili a IZUMO1 e JUNO20,30,31,32,33,34,35.La proteina 6 associata alla membrana acrosomiale spermatica (SPACA6) è stata identificata come essenziale per la fecondazione in uno studio di mutagenesi murina su larga scala.L'inserimento del transgene nel gene Spaca6 produce spermatozoi non fusibili, sebbene questi spermatozoi si infiltrino nello spazio perivitellino36.Successivi studi knockout sui topi hanno confermato che Spaca6 è necessario per la fusione dei gameti30,32.SPACA6 è espresso quasi esclusivamente nei testicoli e ha un modello di localizzazione simile a quello di IZUMO1, cioè nell'intima degli spermatozoi prima della reazione acrosomiale, per poi migrare nella regione equatoriale dopo la reazione acrosomiale30,32.Gli omologhi di Spaca6 esistono in una varietà di mammiferi e altri eucarioti 30 e la loro importanza per la fusione dei gameti umani è stata dimostrata dall'inibizione della fecondazione umana in vitro mediante resistenza a SPACA6 30 .A differenza di IZUMO1 e JUNO, i dettagli della struttura, delle interazioni e della funzione di SPACA6 rimangono poco chiari.
Per comprendere meglio il processo fondamentale alla base della fusione di sperma e ovuli umani, che ci consentirà di informare gli sviluppi futuri nella pianificazione familiare e nel trattamento della fertilità, abbiamo condotto studi strutturali e biochimici SPACA6.La struttura cristallina del dominio extracellulare di SPACA6 mostra un fascio a quattro eliche (4HB) e un dominio simile alle immunoglobuline (simili a Ig) collegati da regioni quasi flessibili.Come previsto in studi precedenti,7,32,37 la struttura del dominio di SPACA6 è simile a quella dell'IZUMO1 umano e le due proteine ​​condividono un motivo insolito: 4HB con una superficie elicoidale triangolare e una coppia di motivi CXXC legati al disolfuro.Proponiamo che IZUMO1 e SPACA6 ora definiscano una superfamiglia di proteine ​​più ampia e strutturalmente correlata associata alla fusione dei gameti.Utilizzando caratteristiche uniche della superfamiglia, abbiamo condotto una ricerca esaustiva del proteoma strutturale umano AlphaFold, identificando ulteriori membri di questa superfamiglia, inclusi diversi membri coinvolti nella fusione dei gameti e/o nella fecondazione.Sembra ora che esista una piega strutturale comune e una superfamiglia di proteine ​​associate alla fusione dei gameti, e la nostra struttura fornisce una mappa molecolare di questo importante aspetto del meccanismo di fusione dei gameti umani.
SPACA6 è una proteina transmembrana a passaggio singolo con un glicano legato all'N e sei presunti legami disolfuro (Figure S1a e S2).Abbiamo espresso il dominio extracellulare di SPACA6 umano (residui 27–246) nelle cellule di Drosophila S2 e purificato la proteina utilizzando l'affinità del nichel, lo scambio cationico e la cromatografia ad esclusione dimensionale (Fig. S1b).L'ectodominio SPACA6 purificato è molto stabile e omogeneo.L'analisi mediante cromatografia ad esclusione dimensionale combinata con diffusione poligonale della luce (SEC-MALS) ha rivelato un picco con un peso molecolare calcolato di 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Ciò è coerente con la dimensione dell'ectodominio monomerico SPACA6, indicando che l'oligomerizzazione non si è verificata durante la purificazione.Inoltre, la spettroscopia del dicroismo circolare (CD) ha rivelato una struttura mista α/β con un punto di fusione di 51,3 ° C (Fig. S1d, e).La deconvoluzione degli spettri CD ha rivelato il 38,6% di elementi α-elicoidali e il 15,8% di elementi β-stranded (Figura S1d).
L'ectodominio SPACA6 è stato cristallizzato utilizzando la semina di matrice casuale38 ottenendo un set di dati con una risoluzione di 2,2 Å (Tabella 1 e Figura S3).Utilizzando una combinazione di sostituzione molecolare basata su frammenti e dati di fasatura SAD con esposizione al bromuro per la determinazione della struttura (Tabella 1 e Figura S4), il modello raffinato finale è costituito dai residui 27–246.Al momento della determinazione della struttura, non erano disponibili strutture sperimentali o AlphaFold.L'ectodominio SPACA6 misura 20 Å × 20 Å × 85 Å, è costituito da sette eliche e nove filamenti β e ha una piega terziaria allungata stabilizzata da sei legami disolfuro (Fig. 1a, b).La debole densità elettronica all'estremità della catena laterale Asn243 indica che questo residuo è una glicosilazione N-legata.La struttura è costituita da due domini: un fascio a quattro eliche N-terminale (4HB) e un dominio simile a Ig C-terminale con una regione di cerniera intermedia tra di loro (Fig. 1c).
a Struttura del dominio extracellulare di SPACA6.Diagramma a strisce del dominio extracellulare di SPACA6, il colore della catena dal terminale N al C-terminale dal blu scuro al rosso scuro.Le cisteine ​​coinvolte nei legami disolfuro sono evidenziate in magenta.b Topologia del dominio extracellulare di SPACA6.Utilizzare la stessa combinazione di colori della Figura 1a.c Dominio extracellulare SPACA6.I grafici delle strisce di dominio 4HB, cerniera e tipo Ig sono colorati rispettivamente in arancione, verde e blu.Gli strati non sono disegnati in scala.
Il dominio 4HB di SPACA6 comprende quattro eliche principali (eliche 1–4), che sono disposte sotto forma di un'elica elicoidale (Fig. 2a), alternando interazioni antiparallele e parallele (Fig. 2b).Una piccola elica aggiuntiva a giro singolo (elica 1′) è disposta perpendicolarmente al fascio, formando un triangolo con le eliche 1 e 2. Questo triangolo è leggermente deformato nell'impaccamento elicoidale dell'impaccamento relativamente denso delle eliche 3 e 4 ( Figura 2a).
Grafico delle strisce N-terminali 4HB.b Vista dall'alto di un fascio di quattro eliche, ciascuna elica evidenziata in blu scuro all'estremità N e rosso scuro all'estremità C.c Diagramma della ruota a spirale dall'alto verso il basso per 4HB, con ciascun residuo mostrato come un cerchio etichettato con un codice amminoacidico a lettera singola;solo i quattro amminoacidi nella parte superiore della ruota sono numerati.I residui non polari sono colorati di giallo, i residui polari non carichi sono colorati di verde, i residui caricati positivamente sono colorati di blu e i residui carichi negativamente sono colorati di rosso.d Facce triangolari del dominio 4HB, con 4HB in arancione e cerniere in verde.Entrambi gli inserti mostrano legami disolfuro a forma di bastoncino.
4HB è concentrato su un nucleo idrofobico interno composto principalmente da residui alifatici e aromatici (Fig. 2c).Il nucleo contiene un legame disolfuro tra Cys41 e Cys55 che collega insieme le eliche 1 e 2 in un triangolo rialzato superiore (Fig. 2d).Sono stati formati due ulteriori legami disolfuro tra il motivo CXXC nell'elica 1 ′ e un altro motivo CXXC trovato sulla punta della forcina β nella regione della cerniera (Fig. 2d).Un residuo conservativo di arginina con una funzione sconosciuta (Arg37) si trova all'interno di un triangolo cavo formato dalle eliche 1′, 1 e 2. Gli atomi di carbonio alifatici Cβ, Cγ e Cδ Arg37 interagiscono con il nucleo idrofobico e i suoi gruppi guanidinici si muovono ciclicamente tra le eliche 1 ′ e 1 tramite interazioni tra la spina dorsale Thr32 e la catena laterale (Fig. S5a, b).Tyr34 si estende nella cavità lasciando due piccole cavità attraverso le quali Arg37 può interagire con il solvente.
I domini β-sandwich simili a Ig sono una grande superfamiglia di proteine ​​che condividono la caratteristica comune di due o più fogli β anfipatici multi-strand che interagiscono tramite un nucleo idrofobico 39. Il dominio Ig-like C-terminale di SPACA6 ha lo stesso modello ed è costituito da due strati (Fig. S6a).Il foglio 1 è un foglio β di quattro filamenti (filamenti D, F, H e I) dove i filamenti F, H e I formano una disposizione antiparallela e i filamenti I e D assumono un'interazione parallela.La Tabella 2 è un piccolo foglio beta a doppio filamento antiparallelo (fili E e G).È stato osservato un legame disolfuro interno tra il terminale C della catena E e il centro della catena H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Questo legame disolfuro è analogo al legame disolfuro nel dominio β-sandwich dell'immunoglobulina40,41.
Il foglio β a quattro fili si attorciglia per tutta la sua lunghezza, formando bordi asimmetrici che differiscono per forma ed elettrostatica.Il bordo più sottile è una superficie ambientale piatta idrofobica che si distingue rispetto alle rimanenti superfici irregolari ed elettrostaticamente diverse in SPACA6 (Fig. S6b,c).Un alone di gruppi carbonilici / amminici della spina dorsale esposta e catene laterali polari circonda la superficie idrofobica (Fig. S6c).Il margine più ampio è coperto da un segmento elicoidale ricoperto che blocca la porzione N-terminale del nucleo idrofobo e forma tre legami idrogeno con il gruppo polare aperto della catena F (Fig. S6d).La porzione C-terminale di questo bordo forma una grande tasca con un nucleo idrofobico parzialmente esposto.La tasca è circondata da cariche positive dovute a tre serie di doppi residui di arginina (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 e Arg212-Arg214) e un'istidina centrale (His220) (Figura S6e).
La regione cerniera è un breve segmento tra il dominio elicoidale e il dominio Ig-like, costituito da uno strato β a tre filamenti antiparalleli (fili A, B e C), una piccola elica 310 e diversi segmenti elicoidali lunghi casuali.(Fig. S7).Una rete di contatti covalenti ed elettrostatici nella regione della cerniera sembra stabilizzare l'orientamento tra 4HB e il dominio Ig-like.La rete può essere divisa in tre parti.La prima parte comprende due motivi CXXC (27CXXC30 e 139CXXC142) che formano una coppia di legami disolfuro tra la forcina β nella cerniera e l'elica 1' in 4HB.La seconda parte comprende le interazioni elettrostatiche tra il dominio Ig-like e la cerniera.Glu132 nella cerniera forma un ponte salino con Arg233 nel dominio Ig-like e Arg135 nella cerniera.La terza parte comprende un legame covalente tra il dominio Ig-like e la regione cerniera.Due legami disolfuro (Cys124-Cys147 e Cys128-Cys153) collegano l'anello cerniera a un linker che è stabilizzato dalle interazioni elettrostatiche tra Gln131 e il gruppo funzionale backbone, consentendo l'accesso al primo dominio simile a Ig.catena.
La struttura dell'ectodominio SPACA6 e le singole strutture dei domini 4HB e Ig-like sono state utilizzate per cercare record strutturalmente simili nei database delle proteine ​​42.Abbiamo identificato corrispondenze con punteggi Dali Z elevati, deviazioni standard piccole e punteggi LALI elevati (quest'ultimo è il numero di residui strutturalmente equivalenti).Mentre i primi 10 risultati della ricerca completa dell'ectodominio (Tabella S1) avevano un punteggio Z accettabile di> 842, una ricerca del solo dominio 4HB o Ig-like ha mostrato che la maggior parte di questi risultati corrispondeva solo ai β-sandwich.una piega ubiquitaria presente in molte proteine.Tutte e tre le ricerche a Dali hanno prodotto un solo risultato: IZUMO1.
È stato a lungo suggerito che SPACA6 e IZUMO1 condividano somiglianze strutturali7,32,37.Sebbene gli ectodomini di queste due proteine ​​associate alla fusione dei gameti condividano solo il 21% dell'identità di sequenza (Figura S8a), prove complesse, tra cui un modello di legame disolfuro conservato e un dominio simile a Ig C-terminale previsto in SPACA6, hanno consentito i primi tentativi di costruire un modello di omologia di A un topo SPACA6 utilizzando IZUMO1 come modello37.La nostra struttura conferma queste previsioni e mostra il vero grado di somiglianza.Infatti, le strutture SPACA6 e IZUMO137,43,44 condividono la stessa architettura a due domini (Fig. S8b) con domini β-sandwich simili 4HB e Ig collegati da una regione cerniera (Fig. S8c).
IZUMO1 e SPACA6 4HB presentano differenze comuni rispetto ai tradizionali fasci a spirale.I tipici 4HB, come quelli trovati nei complessi proteici SNARE coinvolti nella fusione endosomiale 45,46, hanno eliche equidistanti che mantengono una curvatura costante attorno a un asse centrale 47. Al contrario, i domini elicoidali sia in IZUMO1 che in SPACA6 erano distorti, con curvatura variabile e imballaggio non uniforme (figura S8d).La torsione, probabilmente causata dal triangolo formato dalle eliche 1′, 1 e 2, è mantenuta in IZUMO1 e SPACA6 e stabilizzata dallo stesso motivo CXXC sull'elica 1′.Tuttavia, il legame disolfuro aggiuntivo trovato in SPACA6 (Cys41 e Cys55 che collegano covalentemente le eliche 1 e 2 sopra) crea un apice più nitido all'apice del triangolo, rendendo SPACA6 più contorto di IZUMO1, con triangoli di cavità più pronunciati.Inoltre, IZUMO1 manca di Arg37 osservato al centro di questa cavità in SPACA6.Al contrario, IZUMO1 ha un nucleo idrofobico più tipico di residui alifatici e aromatici.
IZUMO1 ha un dominio simile a Ig costituito da un foglio β a doppio e cinque filamenti43.Il filo extra in IZUMO1 sostituisce la bobina in SPACA6, che interagisce con il filo F per limitare i legami idrogeno della spina dorsale nel filo.Un interessante punto di confronto è la carica superficiale prevista dei domini Ig-like delle due proteine.La superficie IZUMO1 è caricata più negativamente rispetto alla superficie SPACA6.Una carica aggiuntiva si trova vicino al terminale C rivolto verso la membrana dello sperma.In SPACA6, le stesse regioni erano più neutre o caricate positivamente (Fig. S8e).Ad esempio, la superficie idrofobica (bordi più sottili) e le cavità caricate positivamente (bordi più larghi) in SPACA6 sono caricate negativamente in IZUMO1.
Sebbene la relazione e gli elementi della struttura secondaria tra IZUMO1 e SPACA6 siano ben conservati, l'allineamento strutturale dei domini Ig-like ha mostrato che i due domini differiscono nel loro orientamento generale l'uno rispetto all'altro (Fig. S9).Il fascio a spirale di IZUMO1 è curvato attorno al sandwich β, creando la forma a “boomerang” precedentemente descritta a circa 50° dall’asse centrale.Al contrario, il raggio elicoidale in SPACA6 era inclinato di circa 10° nella direzione opposta.Le differenze in questi orientamenti sono probabilmente dovute a differenze nella regione della cerniera.A livello di sequenza primaria, IZUMO1 e SPACA6 condividono poca somiglianza di sequenza a livello della cerniera, ad eccezione dei residui di cisteina, glicina e acido aspartico.Di conseguenza, i legami idrogeno e le reti elettrostatiche sono completamente diversi.Gli elementi della struttura secondaria del foglio β sono condivisi da IZUMO1 e SPACA6, sebbene le catene in IZUMO1 siano molto più lunghe e l'elica 310 (elica 5) sia unica di SPACA6.Queste differenze determinano diversi orientamenti dei domini per due proteine ​​altrimenti simili.
La nostra ricerca sul server Dali ha rivelato che SPACA6 e IZUMO1 sono le uniche due strutture determinate sperimentalmente archiviate nel database delle proteine ​​che hanno questa particolare piega 4HB (Tabella S1).Più recentemente, DeepMind (Alphabet/Google) ha sviluppato AlphaFold, un sistema basato su reti neurali in grado di prevedere con precisione le strutture 3D delle proteine ​​a partire dalle sequenze primarie48.Poco dopo aver risolto la struttura SPACA6, è stato rilasciato il database AlphaFold, che fornisce modelli di struttura predittiva che coprono il 98,5% di tutte le proteine ​​nel proteoma umano48,49.Utilizzando la nostra struttura SPACA6 risolta come modello di ricerca, una ricerca di omologia strutturale per il modello nel proteoma umano AlphaFold ha identificato candidati con possibili somiglianze strutturali con SPACA6 e IZUMO1.Data l'incredibile precisione di AlphaFold nel prevedere SPACA6 (Fig. S10a), in particolare l'ectodominio di 1,1 Å rms rispetto alla nostra struttura risolta (Fig. S10b), possiamo essere certi che le corrispondenze SPACA6 identificate saranno probabilmente accurate.
In precedenza, PSI-BLAST cercava il cluster IZUMO1 con altre tre proteine ​​associate allo sperma: IZUMO2, IZUMO3 e IZUMO450.AlphaFold ha previsto che queste proteine ​​della famiglia IZUMO si ripieghino nel dominio 4HB con lo stesso modello di legame disolfuro di IZUMO1 (Figure 3a e S11), sebbene manchino di un dominio simile a Ig.Si ipotizza che IZUMO2 e IZUMO3 siano proteine ​​di membrana unilaterali simili a IZUMO1, mentre IZUMO4 sembra essere secreto.Le funzioni delle proteine ​​IZUMO 2, 3 e 4 nella fusione dei gameti non sono state determinate.È noto che IZUMO3 svolge un ruolo nella biogenesi acrosomiale durante lo sviluppo degli spermatozoi51 e la proteina IZUMO forma un complesso50.La conservazione delle proteine ​​IZUMO nei mammiferi, nei rettili e negli anfibi suggerisce che la loro potenziale funzione è coerente con quella di altre proteine ​​note associate alla fusione dei gameti, come DCST1/2, SOF1 e FIMP.
Diagramma dell'architettura del dominio della superfamiglia IST, con i domini 4HB, cerniera e tipo Ig evidenziati rispettivamente in arancione, verde e blu.IZUMO4 ha una regione C-terminale unica che sembra nera.I legami disolfuro confermati e presunti sono mostrati rispettivamente da linee continue e tratteggiate.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) e TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) sono visualizzati nella stessa gamma di colori del pannello A. I legami disolfuro sono mostrati in magenta.Le eliche transmembrana TMEM95, IZUMO2 e IZUMO3 non sono mostrate.
A differenza della proteina IZUMO, si ritiene che altre proteine ​​SPACA (vale a dire SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 e SPACA9) siano strutturalmente diverse da SPACA6 (Fig. S12).Solo SPACA9 ha 4HB, ma non si prevede che abbia lo stesso orientamento parallelo-antiparallelo o lo stesso legame disolfuro di SPACA6.Solo SPACA1 ha un dominio simile a Ig simile.AlphaFold prevede che SPACA3, SPACA4 e SPACA5 abbiano una struttura completamente diversa da SPACA6.È interessante notare che anche SPACA4 è noto per svolgere un ruolo nella fecondazione, ma in misura maggiore rispetto a SPACA6, facilitando invece l'interazione tra spermatozoi e zona pellucida dell'ovocita52.
La nostra ricerca AlphaFold ha trovato un'altra corrispondenza per IZUMO1 e SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, una singola proteina transmembrana specifica dello sperma, rende sterili i topi maschi dopo l'ablazione 32,33.Gli spermatozoi privi di TMEM95 avevano morfologia, motilità e capacità normali di penetrare nella zona pellucida e legarsi alla membrana dell'uovo, ma non potevano fondersi con la membrana dell'ovocita.Studi precedenti hanno dimostrato che TMEM95 condivide somiglianze strutturali con IZUMO133.In effetti, il modello AlphaFold ha confermato che TMEM95 è un 4HB con la stessa coppia di motivi CXXC di IZUMO1 e SPACA6 e lo stesso legame disolfuro aggiuntivo tra le eliche 1 e 2 trovato in SPACA6 (Fig. 3a e S11).Sebbene TMEM95 sia privo di un dominio simile a Ig, ha una regione con un modello di legame disolfuro simile alle regioni cerniera SPACA6 e IZUMO1 (Fig. 3b).Al momento della pubblicazione di questo manoscritto, il server di prestampa riportava la struttura di TMEM95, confermando il risultato AlphaFold53.TMEM95 è molto simile a SPACA6 e IZUMO1 ed è evolutivamente conservato già negli anfibi (Fig. 4 e S13).
La ricerca PSI-BLAST ha utilizzato i database NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP e SOF1 per determinare la posizione di queste sequenze nell'albero della vita.Le distanze tra i punti di diramazione non vengono mostrate in scala.
La sorprendente somiglianza strutturale complessiva tra SPACA6 e IZUMO1 suggerisce che sono membri fondatori di una superfamiglia strutturale conservata che include le proteine ​​TMEM95 e IZUMO 2, 3 e 4.membri noti: IZUMO1, SPACA6 e TMEM95.Poiché solo pochi membri possiedono domini di tipo Ig, il segno distintivo della superfamiglia IST è il dominio 4HB, che ha caratteristiche uniche comuni a tutte queste proteine: 1) 4HB a spirale con eliche disposte in un'alternanza antiparallela/parallela (Fig . 5a), 2) il fascio ha una faccia triangolare costituita da due eliche all'interno del fascio e una terza elica verticale (area chiave della Fig. (Fig. 5c). È noto che il motivo CXXC, presente nelle proteine ​​simili alla tioredossina, funziona come sensore redox54,55,56, mentre il motivo nei membri della famiglia IST può essere associato alle proteine ​​disolfuro isomerasi come ERp57 nella fusione dei gameti. I ruoli sono associati 57,58.
I membri della superfamiglia IST sono definiti da tre caratteristiche del dominio 4HB: quattro eliche alternate tra orientamento parallelo e antiparallelo, facce del fascio elicoidale ba-triangolare e un doppio motivo ca CXXC formato tra piccole molecole.) Eliche N-terminali (arancione) e regione cerniera β-hairpin (verde).
Data la somiglianza tra SPACA6 e IZUMO1, è stata testata la capacità del primo di legarsi a IZUMO1 o JUNO.L'interferometria del biostrato (BLI) è un metodo di legame basato sulla cinetica precedentemente utilizzato per quantificare l'interazione tra IZUMO1 e JUNO.Dopo l'incubazione del sensore marcato con biotina con IZUMO1 come esca con un'alta concentrazione di analita JUNO, è stato rilevato un segnale forte (Fig. S14a), che indica un cambiamento indotto dal legame nello spessore del biomateriale attaccato alla punta del sensore.Segnali simili (cioè JUNO accoppiato al sensore come esca contro l'analita IZUMO1) (Fig. S14b).Nessun segnale è stato rilevato quando SPACA6 è stato utilizzato come analita contro IZUMO1 legato al sensore o JUNO legato al sensore (Figura S14a,b).L'assenza di questo segnale indica che il dominio extracellulare di SPACA6 non interagisce con il dominio extracellulare di IZUMO1 o JUNO.
Poiché il test BLI si basa sulla biotinilazione dei residui di lisina liberi sulla proteina dell'esca, questa modifica può impedire il legame se i residui di lisina sono coinvolti nell'interazione.Inoltre, l'orientamento del legame rispetto al sensore può creare ostacoli sterici, quindi sono stati eseguiti anche test pull-down convenzionali sugli ectodomini ricombinanti SPACA6, IZUMO1 e JUNO.Nonostante ciò, SPACA6 non è precipitato con IZUMO1 con tag His o JUNO con tag His (Fig. S14c, d), indicando alcuna interazione coerente con quella osservata negli esperimenti BLI.Come controllo positivo, abbiamo confermato l'interazione di JUNO con His IZUMO1 etichettato (Figure S14e e S15).
Nonostante la somiglianza strutturale tra SPACA6 e IZUMO1, l'incapacità di SPACA6 di legarsi a JUNO non è sorprendente.La superficie dell'IZUMO1 umano ha più di 20 residui che interagiscono con JUNO, inclusi residui di ciascuna delle tre regioni (sebbene la maggior parte di essi si trovi nella regione della cerniera) (Fig. S14f).Di questi residui, solo uno è conservato in SPACA6 (Glu70).Mentre molte sostituzioni di residui hanno mantenuto le loro proprietà biochimiche originali, il residuo essenziale Arg160 in IZUMO1 è stato sostituito dall'Asp148 caricato negativamente in SPACA6;studi precedenti hanno dimostrato che la mutazione Arg160Glu in IZUMO1 abolisce quasi completamente il legame con JUNO43.Inoltre, la differenza nell'orientamento del dominio tra IZUMO1 e SPACA6 ha aumentato significativamente l'area superficiale del sito di legame JUNO della regione equivalente su SPACA6 (Fig. S14g).
Nonostante la nota necessità di SPACA6 per la fusione dei gameti e la sua somiglianza con IZUMO1, SPACA6 non sembra avere una funzione di legame JUNO equivalente.Pertanto, abbiamo cercato di combinare i nostri dati strutturali con le prove di importanza fornite dalla biologia evoluzionistica.L'allineamento della sequenza degli omologhi SPACA6 mostra la conservazione della struttura comune oltre i mammiferi.Ad esempio, residui di cisteina sono presenti anche in anfibi lontanamente imparentati (Fig. 6a).Utilizzando il server ConSurf, i dati di conservazione dell'allineamento di sequenze multiple di 66 sequenze sono stati mappati sulla superficie SPACA6.Questo tipo di analisi può mostrare quali residui sono stati conservati durante l'evoluzione delle proteine ​​e può indicare quali regioni superficiali svolgono un ruolo nella funzione.
un allineamento di sequenze di ectodomini SPACA6 di 12 specie diverse preparati utilizzando CLUSTAL OMEGA.Secondo l’analisi ConSurf, le posizioni più conservatrici sono contrassegnate in blu.I residui di cisteina sono evidenziati in rosso.I confini del dominio e gli elementi della struttura secondaria sono mostrati nella parte superiore dell'allineamento, dove le frecce indicano i filamenti β e le onde indicano le eliche.Gli identificatori di accesso NCBI contenenti le sequenze sono: umano (Homo sapiens, NP_001303901), mandrillo (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), scimmia cappuccino (Cebus mimic, XP_017359366), cavallo (Equus caballus, XP_023506102), orca assassina (Orcinus orca3_23 XP_032_ 034).), pecora (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), cane (Canis lupus familyis, XP_025277208), topo (Mus musculus, NP_001156381), diavolo della Tasmania (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), ornitorinco, 8) , 61_89 e Rana toro (Bufo bufo, XP_040282113).La numerazione si basa sull'ordine umano.b Rappresentazione superficiale della struttura SPACA6 con 4HB in alto e dominio simile a Ig in basso, colori basati sulle stime di conservazione del server ConSurf.Le parti meglio conservate sono in blu, le parti moderatamente conservate sono in bianco e le meno conservate sono in giallo.cisteina viola.Tre patch superficiali che dimostrano un elevato livello di protezione sono mostrate nel riquadro etichettato patch 1, 2 e 3. Una vignetta 4HB è mostrata nel riquadro in alto a destra (stessa combinazione di colori).
La struttura SPACA6 ha tre regioni superficiali altamente conservate (Fig. 6b).La patch 1 si estende su 4HB e sulla regione della cerniera e contiene due ponti disolfuro CXXC conservati, una rete di cerniere Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) e tre residui aromatici esterni conservati (Phe31, Tyr73, Phe137)).un bordo più ampio del dominio Ig-like (Fig. S6e), che rappresenta diversi residui caricati positivamente sulla superficie dello sperma.È interessante notare che questo cerotto contiene un epitopo anticorpale che in precedenza ha dimostrato di interferire con la funzione SPACA6 30.La regione 3 si estende sulla cerniera e su un lato del dominio di tipo Ig;questa regione contiene proline conservate (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) e residui polari/carichi rivolti verso l'esterno.Sorprendentemente, la maggior parte dei residui sulla superficie di 4HB sono altamente variabili (Fig. 6b), sebbene la piega sia conservata in tutto l'omologo SPACA6 (come indicato dal conservatorismo del nucleo del fascio idrofobico) e oltre la superfamiglia IST.
Sebbene questa sia la regione più piccola di SPACA6 con il minor numero di elementi di struttura secondaria rilevabili, molti resti di regioni di cerniera (inclusa la regione 3) sono altamente conservati tra gli omologhi di SPACA6, il che può indicare che l'orientamento del fascio elicoidale e del sandwich β gioca un ruolo.come conservatore.Tuttavia, nonostante gli estesi legami idrogeno e le reti elettrostatiche nella regione cerniera di SPACA6 e IZUMO1, è possibile vedere prove di flessibilità intrinseca nell'allineamento delle molteplici strutture consentite di IZUMO137,43,44.L'allineamento dei singoli domini si sovrapponeva bene, ma l'orientamento dei domini l'uno rispetto all'altro variava da 50° a 70° rispetto all'asse centrale (Fig. S16).Per comprendere le dinamiche conformazionali di SPACA6 in soluzione, sono stati eseguiti esperimenti SAXS (Fig. S17a, b).La ricostruzione ab initio dell'ectodominio SPACA6 era conforme a una struttura cristallina a bastoncino (Fig. S18), sebbene il grafico di Kratky mostrasse un certo grado di flessibilità (Fig. S17b).Questa conformazione contrasta con IZUMO1, in cui la proteina non legata assume una forma a boomerang sia nel reticolo che in soluzione43.
Per identificare specificamente la regione flessibile, la spettroscopia di massa a scambio idrogeno-deuterio (H-DXMS) è stata eseguita su SPACA6 e confrontata con i dati precedentemente ottenuti su IZUMO143 (Fig. 7a,b).SPACA6 è chiaramente più flessibile di IZUMO1, come indicato da uno scambio di deuterio più elevato in tutta la struttura dopo 100.000 s di scambio.In entrambe le strutture, la parte C-terminale della regione cerniera mostra un elevato livello di scambio, che probabilmente consente una rotazione limitata dei domini 4HB e Ig-like l'uno rispetto all'altro.È interessante notare che la parte C-terminale della cerniera SPACA6, costituita dal residuo 147CDLPLDCP154, è una regione 3 altamente conservata (Fig. 6b), indicando forse che la flessibilità interdominio è una caratteristica evolutivamente conservata di SPACA6.Secondo l'analisi di flessibilità, i dati di fusione termica del CD hanno mostrato che SPACA6 (Tm = 51,2°C) è meno stabile di IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e e S19).
a Immagini H-DXMS di SPACA6 e b IZUMO1.La percentuale di scambio di deuterio è stata determinata nei punti temporali indicati.I livelli di scambio idrogeno-deuterio sono indicati dal colore su una scala gradiente dal blu (10%) al rosso (90%).Le scatole nere rappresentano aree ad alto scambio.I confini di 4HB, cerniera e dominio simile a Ig osservati nella struttura cristallina sono mostrati sopra la sequenza primaria.I livelli di scambio del deuterio a 10 s, 1000 s e 100.000 s sono stati tracciati su un grafico a strisce sovrapposto alle superfici molecolari trasparenti di SPACA6 e IZUMO1.Parti di strutture con un livello di scambio di deuterio inferiore al 50% sono colorate di bianco.Le aree superiori al 50% di scambio H-DXMS sono colorate in una scala gradiente.
L’uso di CRISPR/Cas9 e di strategie genetiche di eliminazione del gene del topo ha portato all’identificazione di diversi fattori importanti per il legame e la fusione di spermatozoi e ovuli.A parte l'interazione ben caratterizzata della struttura IZUMO1-JUNO e CD9, la maggior parte delle proteine ​​associate alla fusione dei gameti rimangono strutturalmente e funzionalmente enigmatiche.La caratterizzazione biofisica e strutturale di SPACA6 è un altro pezzo del puzzle molecolare di adesione/fusione durante la fecondazione.
SPACA6 e altri membri della superfamiglia IST sembrano essere altamente conservati nei mammiferi così come nei singoli uccelli, rettili e anfibi;infatti, si ritiene che SPACA6 sia richiesto anche per la fecondazione nel pesce zebra 59. Questa distribuzione è simile ad altre proteine ​​note associate alla fusione dei gameti come DCST134, DCST234, FIMP31 e SOF132, suggerendo che questi fattori sono carenti di HAP2 (anche note come GCS1) proteine ​​responsabili dell'attività catalitica di molti protisti., piante e artropodi.Proteine ​​di fusione fecondate 60, 61. Nonostante la forte somiglianza strutturale tra SPACA6 e IZUMO1, l'eliminazione dei geni che codificano per entrambe queste proteine ​​ha provocato infertilità nei topi maschi, indicando che le loro funzioni nella fusione dei gameti non sono duplicate..Più in generale, nessuna delle proteine ​​spermatiche conosciute necessarie per la fase di adesione della fusione è ridondante.
Resta una questione aperta se SPACA6 (e altri membri della superfamiglia IST) partecipino alle giunzioni intergametiche, formino reti intragametiche per reclutare proteine ​​importanti nei punti di fusione o forse addirittura agiscano come sfuggenti fusogeni.Studi di co-immunoprecipitazione nelle cellule HEK293T hanno rivelato un'interazione tra IZUMO1 a lunghezza intera e SPACA632.Tuttavia, i nostri ectodomini ricombinanti non hanno interagito in vitro, suggerendo che le interazioni osservate in Noda et al.sono stati entrambi eliminati nel costrutto (notare la coda citoplasmatica di IZUMO1, che si è rivelata non necessaria per la fecondazione62).In alternativa, IZUMO1 e/o SPACA6 possono richiedere ambienti di legame specifici che non riproduciamo in vitro, come conformazioni fisiologicamente specifiche o complessi molecolari contenenti altre proteine ​​(conosciute o non ancora scoperte).Sebbene si ritenga che l'ectodominio IZUMO1 medi l'attaccamento degli spermatozoi all'uovo nello spazio perivitellino, lo scopo dell'ectodominio SPACA6 non è chiaro.
La struttura di SPACA6 rivela diverse superfici conservate che potrebbero essere coinvolte nelle interazioni proteina-proteina.La parte conservata della regione cerniera immediatamente adiacente al motivo CXXC (designata Patch 1 sopra) presenta diversi residui aromatici rivolti verso l'esterno che sono spesso associati a interazioni idrofobiche e di impilamento π tra biomolecole.I lati larghi del dominio Ig-like (regione 2) formano un solco carico positivamente con residui di Arg e His altamente conservati, e anticorpi contro questa regione sono stati precedentemente utilizzati per bloccare la fusione dei gameti 30 .L'anticorpo riconosce l'epitopo lineare 212RIRPAQLTHRGTFS225, che ha tre dei sei residui di arginina e His220 altamente conservato.Non è chiaro se la disfunzione sia dovuta al blocco di questi specifici residui o dell'intera regione.La posizione di questo spazio vicino al terminale C del sandwich β indica interazioni cis con le vicine proteine ​​dello sperma, ma non con le proteine ​​dell'ovocita.Inoltre, la ritenzione di un groviglio ricco di prolina altamente flessibile (sito 3) all'interno della cerniera potrebbe essere il sito di un'interazione proteina-proteina o, più probabilmente, indicare il mantenimento della flessibilità tra i due domini.Il genere è importante per il ruolo sconosciuto di SPACA6.fusione dei gameti.
SPACA6 ha proprietà di proteine ​​di adesione intercellulari, inclusi i β-sandwich simili a Ig.Molte proteine ​​adesive (ad esempio, caderine, integrine, adesine e IZUMO1) possiedono uno o più domini β-sandwich che estendono le proteine ​​dalla membrana cellulare ai loro bersagli ambientali63,64,65.Il dominio Ig-like di SPACA6 contiene anche un motivo comunemente presente nei sandwich β di adesione e coesione: doppietti di filamenti paralleli alle estremità dei sandwich β, noti come morsetti meccanici66.Si ritiene che questo motivo aumenti la resistenza alle forze di taglio, il che è prezioso per le proteine ​​coinvolte nelle interazioni intercellulari.Tuttavia, nonostante questa somiglianza con le adesine, attualmente non ci sono prove che SPACA6 interagisca con gli albumi.L'ectodominio SPACA6 non è in grado di legarsi a JUNO e le cellule HEK293T che esprimono SPACA6, come mostrato qui, difficilmente interagiscono con gli ovociti privi della zona 32.Se SPACA6 stabilisce legami intergametici, queste interazioni potrebbero richiedere modifiche post-traduzionali o stabilizzazione da parte di altre proteine ​​spermatiche.A sostegno di quest'ultima ipotesi, gli spermatozoi carenti di IZUMO1 si legano agli ovociti, dimostrando che molecole diverse da IZUMO1 sono coinvolte nella fase di adesione dei gameti 27 .
Molte proteine ​​di fusione virali, cellulari e dello sviluppo hanno proprietà che predicono la loro funzione di fusogeni.Ad esempio, le glicoproteine ​​di fusione virali (classi I, II e III) hanno un peptide o un'ansa di fusione idrofobica all'estremità della proteina che viene inserita nella membrana ospite.La mappa dell'idrofilicità di IZUMO143 e la struttura (determinata e prevista) della superfamiglia IST non hanno mostrato alcun peptide di fusione idrofobico apparente.Pertanto, se qualche proteina nella superfamiglia IST funziona come fusogeno, lo fa in modo diverso dagli altri esempi noti.
In conclusione, le funzioni dei membri della superfamiglia IST delle proteine ​​associate alla fusione dei gameti rimangono un mistero allettante.La nostra molecola ricombinante SPACA6 caratterizzata e la sua struttura risolta forniranno informazioni sulle relazioni tra queste strutture condivise e sul loro ruolo nell'attaccamento e nella fusione dei gameti.
La sequenza di DNA corrispondente all'ectodominio SPACA6 umano previsto (numero di accesso NCBI NP_001303901.1; residui 27–246) è stata ottimizzata con codone per l'espressione nelle cellule S2 di Drosophila melanogaster e sintetizzata come frammento genetico con la sequenza che codifica Kozak (Eurofins Genomics)., il segnale di secrezione BiP e le corrispondenti estremità 5' e 3' per la clonazione indipendente dalla ligazione di questo gene in un vettore di espressione pMT basato su un promotore della metallotioneina modificato per la selezione con puromicina (pMT-puro).Il vettore pMT-puro codifica un sito di clivaggio della trombina seguito da un tag C-terminale 10x-His (Figura S2).
La trasfezione stabile del vettore SPACA6 pMT-puro nelle cellule D. melanogaster S2 (Gibco) è stata eseguita in modo simile al protocollo utilizzato per IZUMO1 e JUNO43.Le cellule S2 sono state scongelate e coltivate nel mezzo di Schneider (Gibco) integrato con una concentrazione finale del 10% (v/v) di siero fetale di vitello inattivato con il calore (Gibco) e antibiotico antimicotico 1X (Gibco).Le cellule di passaggio iniziale (3,0 x 106 cellule) sono state piastrate in pozzetti individuali di piastre da 6 pozzetti (Corning).Dopo 24 ore di incubazione a 27°C, le cellule sono state trasfettate con una miscela di 2 mg del vettore SPACA6 pMT-puro e del reagente di trasfezione Effectene (Qiagen) secondo il protocollo del produttore.Le cellule trasfettate sono state incubate per 72 ore e poi raccolte con 6 mg/ml di puromicina.Le cellule sono state quindi isolate dal terreno di Schneider completo e collocate in un terreno Insect-XPRESS privo di siero (Lonza) per la produzione di proteine ​​su larga scala.Un lotto da 1 L di coltura cellulare S2 è stato coltivato fino a 8–10 × 106 ml-1 di cellule in un matraccio Erlenmeyer in polipropilene a fondo piatto ventilato da 2 L e quindi sterilizzato con una concentrazione finale di 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) e filtrato sterile.indotto.Le colture indotte sono state incubate a 27°C a 120 giri al minuto per quattro giorni.
Il mezzo condizionato contenente SPACA6 è stato isolato mediante centrifugazione a 5660×ga 4°C seguita da un sistema di filtrazione a flusso tangenziale Centramate (Pall Corp) con una membrana MWCO da 10 kDa.Applicare il mezzo concentrato contenente SPACA6 a una colonna di resina di agarosio Ni-NTA da 2 ml (Qiagen).La resina Ni-NTA è stata lavata con 10 volumi di colonna (CV) di tampone A e poi è stato aggiunto 1 CV di tampone A per dare una concentrazione finale di imidazolo di 50 mM.SPACA6 è stato eluito con 10 ml di tampone A addizionato con imidazolo ad una concentrazione finale di 500 mM.La trombina della classe di restrizione (Millipore Sigma) è stata aggiunta direttamente al tubo di dialisi (MWCO 12-14 kDa) a 1 unità per mg di SPACA6 rispetto a 1 L di Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 e NaCl 150 mM (tampone B) per la dialisi.) a 4°C per 48 ore.Lo SPACA6 scisso con trombina è stato quindi diluito tre volte per ridurre la concentrazione di sale e caricato su una colonna a scambio cationico MonoS 5/50 GL da 1 ml (Cytiva/GE) equilibrata con Tris-HCl 10 mM, pH 7,5.Lo scambiatore cationico è stato lavato con Tris-HCl 3 OK 10 mM, pH 7,5, quindi SPACA6 è stato eluito con un gradiente lineare da 0 a 500 mm NaCl in Tris-HCl 10 mm, pH 7,5 per 25 OK.Dopo la cromatografia a scambio ionico, SPACA6 è stato concentrato a 1 ml ed eluito isocraticamente da una colonna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrata con tampone B. Secondo il cromatogramma, pool e frazioni concentrate contenenti SPACA6.La purezza è stata controllata mediante elettroforesi colorata con Coomassie su un gel di poliacrilammide SDS al 16%.La concentrazione proteica è stata quantificata mediante assorbanza a 280 nm utilizzando la legge di Beer-Lambert e il coefficiente di estinzione molare teorico.
SPACA6 purificato è stato dializzato durante la notte contro fosfato di sodio 10 mM, pH 7,4 e NaF 150 mM e diluito a 0,16 mg/mL prima dell'analisi mediante spettroscopia CD.La scansione spettrale di CD con una lunghezza d'onda compresa tra 185 e 260 nm è stata raccolta su uno spettropolarimetro Jasco J-1500 utilizzando cuvette al quarzo con una lunghezza del percorso ottico di 1 mm (Helma) a 25°C a una velocità di 50 nm/min.Gli spettri CD sono stati corretti al basale, calcolata la media su 10 acquisizioni e convertiti in ellitticità residua media (θMRE) in gradi cm2/dmol:
dove MW è il peso molecolare di ciascun campione in Da;N è il numero di amminoacidi;θ è l'ellitticità in milligradi;d corrisponde alla lunghezza del cammino ottico in cm;concentrazione di proteine ​​in unità.