Componente chimico per tubi a spirale in acciaio inossidabile 310 10 * 1 mm, i domini N-terminali dello spidroin formano idrogel basati su fibrille amiloidi e forniscono una piattaforma per l'immobilizzazione delle proteine.

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Specifica

310 fornitori di tubi a spirale in acciaio inossidabile da 10 * 1 mm

Composizione chimica

Proprietà meccaniche

Le proteine ​​ricombinanti della seta di ragno (proteine ​​della seta di ragno) hanno molte potenziali applicazioni nello sviluppo di nuovi biomateriali, ma la loro natura multimodale e incline all'aggregazione le rende difficili da ottenere e facili da usare.Qui riportiamo che le proteine ​​ricombinanti della spidroina in miniatura e, soprattutto, il dominio N-terminale (NT) stesso formano rapidamente idrogel autoportanti e trasparenti a 37 ° C.le proteine ​​di fusione costituite da NT e proteina fluorescente verde o fosforilasi nucleosidica purinica formano proteine ​​di fusione completamente funzionali.Idrogel.I nostri risultati mostrano che le proteine ​​NT ricombinanti e di fusione forniscono rese elevate di espressione e conferiscono agli idrogel proprietà attraenti come trasparenza, gelificazione senza reticolazione e immobilizzazione diretta di proteine ​​attive ad alta densità.
I ragni hanno fino a sette diversi gruppi di ghiandole della seta, ciascuna delle quali produce un tipo specifico di seta.Tutte e sette le specie di seta sono composte da proteine ​​della seta di ragno (spidroine) lunghe circa 6000 residui e contengono un'ampia regione centrale ripetuta circondata da domini sferici N e C-terminali (NT e CT)1,2.Il tipo di seta più studiato, l'ampolla primaria, è prodotta dalla ghiandola dell'ampolla primaria.In questa ghiandola, un monostrato di cellule epiteliali sintetizza le proteine ​​spidroina e le secerne nel lume della ghiandola, dove sono presenti in forma solubile (doping) a concentrazioni estremamente elevate (30–50% p/v)3,4.L'organizzazione e la conformazione delle principali proteine ​​spidroina ampollare nella ghiandola è stata dibattuta, ma la maggior parte delle prove sperimentali indica la presenza di una conformazione elicoidale generalmente e/o casuale e di strutture micellari o lamellari5,6,7,8,9,10.Mentre i domini ripetitivi regolano le proprietà meccaniche delle fibre di seta, formando nanocristalli di fogli β e strutture amorfe11,12,13,14,15, i domini terminali regolano le fibre di seta in risposta alle mutevoli condizioni lungo la ghiandola della seta16,17,18.Controllando la formazione della seta, 19. I domini terminali sono conservati evolutivamente e la loro funzione può essere comune a tutte le proteine ​​spidroina 2,20,21.Durante il passaggio attraverso la ghiandola, il pH della spidroina diminuisce da circa 7,6 a < 5,716 e aumenta con le forze di taglio e di allungamento mediate dal movimento attraverso il condotto che si restringe gradualmente.In soluzione, CT è un dimero parallelo costitutivo α-elicoidale17, ma in risposta al basso pH e alle forze di taglio, CT si dispiega e commuta gli strati β16, 17, eventualmente innescando strati β nelle regioni ripetitive di Convert 16. NT sono monomerici sotto condizioni che riflettono le condizioni nel lume della ghiandola e mediano la solubilità della spidroina, ma a pH ridotto, la protonazione di un numero di catene laterali dell'acido carbossilico porta alla dimerizzazione di NT con un pKa di circa 6,5, stabilizzando così NT e fissando la spidroina in grandi quantità le quantità.reti16,18.Pertanto, l'NT svolge un ruolo chiave nella formazione del filamento, trasformandosi da monomero nel rivestimento a dimero nella fibra23,24,25.NT rimane altamente solubile ed elicoidale in tutte le condizioni studiate fino ad oggi16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, che hanno ispirato il suo sviluppo come marcatore che migliora la solubilità per la produzione di proteine ​​eterologhe.
La proteina ricombinante della seta del ragno mini, composta da un NT, una regione di ripetizione breve, una CT e un tag His6 (His-NT2RepCT) per la purificazione, è solubile in tampone acquoso quanto la proteina nativa della seta del ragno e imita importanti caratteristiche native del ragno della seta .copertura 25.31.His-NT2RepCT può essere filato in fibre continue utilizzando una macchina biomimetica in cui un rivestimento solubile a pH 8 viene estruso in un bagnomaria a pH 525,32,33,34,35.La fermentazione nel bioreattore di E. coli che esprime His-NT2RepCT e il successivo post-trattamento hanno prodotto una resa >14 g/L dopo la purificazione.L'elevata resa, l'elevata solubilità e l'adeguata risposta di His-NT2RepCT alle condizioni acide sono tutte attribuite a NT23, 25, 34.
Qui riportiamo la rapida formazione di idrogel trasparenti da proteine ​​ricombinanti di spidroina, inclusa la sola NT, incubando una soluzione proteica a 37 ° C.Utilizzando la fluorescenza della tioflavina T (ThT), la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), abbiamo scoperto che le proteine ​​NT e microspider subiscono una trasformazione strutturale in fogli β e fibrille simili all'amiloide quando si formano i gel.Inoltre, le proteine ​​di fusione di NT e la proteina fluorescente verde (GFP) o la fosforilasi nucleosidica purinica (PNP) formano idrogel con frammenti di fusione completamente funzionali.L'espressione ad alto rendimento in ospiti eterologhi, abbinata alla rapida formazione di idrogel in condizioni fisiologiche, apre la possibilità di una produzione economicamente vantaggiosa di idrogel con funzioni ingegnerizzate.
A differenza della maggior parte delle proteine ​​spidroina ricombinanti segnalate36, His-NT2RepCT è stabile nel tampone Tris-HCl a pH 8 e può essere concentrato fino a 500 mg/mL senza precipitazione25.Pertanto, siamo rimasti sorpresi di scoprire che questa proteina forma rapidamente idrogel otticamente trasparenti e autoportanti quando incubata a 37 ° C (Fig. 1b-d).Ulteriori studi hanno dimostrato che la gelificazione di His-NT2RepCT si è verificata in un ampio intervallo di concentrazioni proteiche (10-300 mg/ml) e che questa concentrazione era inversamente correlata al tempo di gelificazione (Fig. 1c e Fig. 1 supplementare).Per scoprire quali parti di His-NT2RepCT mediano la formazione di idrogel, abbiamo quindi esaminato ciascun dominio individualmente e in varie combinazioni utilizzando un test di inversione del pallone (Figura 1a,b).Tutte le frazioni testate di spidroina ricombinante hanno formato gel (a una concentrazione proteica di 300 mg/mL) in meno di 1 ora, ad eccezione di 2Rep precipitato (Fig. 1b).Ciò suggerisce che NT e CT da soli, in combinazione o associati a ripetizioni, possono gelificare a 37°C e che il tag His6 non influenza questo processo in misura significativa.Data l'idea comune che l'NT è una proteina altamente solubile e stabile e che precedenti rapporti su idrogel di spidroina ricombinante hanno attribuito effetti di gelificazione a cambiamenti conformazionali in regioni ripetute e/o CT, l'NT stesso potrebbe farlo.La scoperta della gelificazione fu inaspettata.Tabella supplementare 1) 37, 38, 39. Sorprendentemente, NT è già gelificato entro 10 minuti ad una concentrazione ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Esperimenti di inversione della fiala con varie concentrazioni di NT hanno mostrato che a >50 mg/mL la soluzione di NT gelificava più velocemente di His-NT2RepCT alla concentrazione corrispondente (p/v, Figura 1c).
Rappresentazione schematica di vari costrutti spidroin studiati in questo lavoro.b Tempo di gelificazione a 37 °C per varie proteine ​​spidroina ricombinanti (300 mg/mL) verificato capovolgendo la fiala.Gel CT immediatamente senza incubazione (<300 mg/mL), 2Rep precipita (300 mg/mL, scala 5 mm).c Tempo di gelificazione di His-NT2RepCT e NT alle concentrazioni proteiche indicate a 37°C.d Fotografie degli idrogel His-NT2RepCT e NT con il ragno e la lettera "NT" stampati sotto, rispettivamente (entrambi 200 mg/mL, barra della scala 5 mm).
Gli idrogel formati da varie proteine ​​spidroina ricombinanti hanno colori leggermente diversi e l'osservazione ad occhio nudo mostra vari gradi di trasparenza (Fig. 1b).I gel NT sono eccezionalmente trasparenti mentre altri gel diventano opachi.I gel His-NT2RepCT e NT colati in tubi cilindrici potrebbero essere rimossi dallo stampo intatti (Fig. 1d).
Per verificare se i rivestimenti naturali in seta di ragno gelificano in condizioni ora accertate che causano la gelificazione delle proteine ​​ricombinanti della spidroina, i rivestimenti sono stati raccolti dalla grande ghiandola ampollare del ragno ponte svedese (Larinioides sclopetarius).I rivestimenti sono stati conservati in tampone Tris-HCl 20 mM a 50 mg/mL (in base al peso secco misurato), ma non è stata osservata alcuna gelificazione durante l'incubazione di 21 giorni a 37 ° C (Figura 2a supplementare).
Per quantificare questi gel, è possibile utilizzare misurazioni reologiche per studiare il processo di gelificazione e determinare le proprietà meccaniche complessive.In particolare, il monitoraggio del modulo di conservazione (elasticità) a temperature elevate può fornire informazioni sulla temperatura di gelificazione e sulle proprietà viscoelastiche del rivestimento.Esperimenti sull'aumento della temperatura (utilizzando 1°C/min a 25-45°C, sulla base di studi precedenti utilizzando soluzioni stock di seta naturale)40,41 hanno dimostrato che i moduli di conservazione delle soluzioni His-NT2RepCT e NT aumentavano con l'aumento della temperatura.è stato aumentato (Fig. 2 e Fig. 3 supplementare).In particolare, il modulo NT ha iniziato a crescere a una temperatura inferiore rispetto a His-NT2RepCT, in linea con il tempo di gelificazione più rapido osservato quando NT è stato incubato direttamente con His-NT2RepCT a 37°C (Figura 1).Dopo un successivo calo di temperatura, il modulo di accumulo non è tornato a valori più bassi ed è rimasto al di sopra del modulo di perdita (vedere Figura 3 supplementare), indicando una gelificazione stabile termicamente irreversibile.Dopo la gelificazione, il modulo elastico finale variava da 15 a 330 kPa per gli idrogel His-NT2RepCT a una concentrazione di 100-500 mg/mL, e il modulo elastico finale per gli idrogel NT (100-500 mg/mL) variava da 2 a 1400 kPa (Fig. , 2 e dati di rampa completi) vedere la Figura 3 supplementare).
a Variazione della temperatura durante le misurazioni di His-NT2RepCT (300 mg/mL) e b NT (300 mg/mL) con agitazione.Le frecce indicano l'andamento della temperatura e l'ombreggiatura più chiara dei dati del modulo di memorizzazione rappresenta il test con valori di coppia dello strumento inferiori a quelli specificati dal produttore, che è la causa dell'aumento del rumore.c Accumulo nel modulo finale di His-NT2RepCT e NT dopo temperatura elevata (100, 300 e 500 mg/mL).Tutte le letture dei moduli vengono effettuate ad una frequenza di 0,1 Hz.
Come potenziale metodo per studiare i cambiamenti conformazionali associati alla gelificazione, abbiamo registrato spettri FTIR di His-NT2RepCT e NT prima e dopo la gelificazione a 37°C (Figura 3a,b).Come previsto, gli spettri delle soluzioni His-NT2RepCT e NT corrispondevano a proteine ​​che mostravano una struttura secondaria ad α-elica/bobina casuale, con una banda pronunciata a 1645 cm-1.Per entrambi gli idrogel, la gelificazione ha portato alla formazione di due bracci nella banda I centrale a circa 1617 cm-1 e 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), indicando la formazione di strutture di fogli β antiparalleli.Questi cambiamenti possono essere visti chiaramente anche nei rispettivi spettri di derivata seconda e di gelificazione della differenza (Figura 4b supplementare).Le due bande dello strato β dell'NT erano più pronunciate di quelle dell'His-NT2RepCT, indicando che il contenuto totale delle bande dello strato β nell'idrogel NT era superiore a quello dell'idrogel NT2RepCT.
a Spettri di assorbimento FTIR di His-NT2RepCT e b NT (entrambi 500 mg/mL) prima (soluzione) e dopo l'incubazione (gel) a 37°C.c Immagini TEM di gel NT2RepCT da 50 mg/ml risospesi e d NT.Barra della scala 200 nm.e Diametri delle fibre degli idrogel His-NT2RepCT e NT.n = 100 fibrille misurate, p <0,0001.Le barre di errore mostrano la deviazione standard.Il centro delle barre di errore è la media.Per l'analisi statistica è stato utilizzato un t-test non accoppiato (a due code).f Fluorescenza ThT di varie proteine ​​ricombinanti della spidroina (100 mg/mL) a 37 °C senza agitazione.Esperimenti di inoculazione di g NT (100 mg/ml) da gel NT da 100 mg/ml con semi allo 0%, 5%, 10% e 20%.
L'analisi del gel mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha mostrato che l'idrogel è costituito da fibrille simili all'amiloide (Figg. 3c, 3d).Le fibrille formate da NT erano allungate (5-12 nm di diametro) e non ramificate, mentre le fibrille His-NT2RepCT erano più corte di lunghezza e significativamente più larghe di diametro (7-16 nm) (Fig. 3e).Questi risultati ci hanno permesso di seguire la cinetica della fibrosi utilizzando il dosaggio della tioflavina T (ThT).Per tutte le proteine ​​​​spidroina ricombinanti, il segnale fluorescente è aumentato quando i campioni sono stati incubati a 37 ° C (Fig. 3f, Fig. 5a supplementare).Coerentemente con questo risultato, l'esame microscopico di NT e His-NT2RepCT in condizioni di gelificazione ha rivelato un aumento uniforme della fluorescenza ThT senza notevole accumulo locale di aggregati ThT-positivi (Figura 5b,c supplementare).La formazione di fibrille ThT-positive non è stata accompagnata da un aumento della torbidità di NT e His-NTCT (Figura 5d supplementare), il che significa che una rete di fibrille nel gel potrebbe formarsi senza compromettere la trasparenza del gel.La semina aggiungendo piccole quantità di fibrille preformate può accelerare significativamente la formazione di fibrille di alcuni amiloidi42,43,44 ma aggiungendo il 5%, 10% o 20% (p/p) di NT a una soluzione di idrocoagulanti NT.effetto semina (Fig. 3g).Forse ciò è dovuto al fatto che le fibrille nell'idrogel sono relativamente fisse e non possono essere utilizzate come semi.
Il comportamento inaspettato delle proteine ​​ricombinanti della spidroina alle alte temperature ha spinto a ulteriori studi di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) per identificare i cambiamenti conformazionali associati alla formazione di gel.Gli spettri NMR delle soluzioni His-NT2RepCT registrati nel tempo a 37°C hanno mostrato che CT era ancora parzialmente piegato, mentre i segnali NT e 2Rep erano scomparsi (Fig. 4a), suggerendo che erano principalmente NT e 2Rep a controllare parzialmente la formazione di His- Idrogel NT2RepCT.Anche il segnale CT è stato attenuato al 20% della sua intensità originale, suggerendo che anche il CT è per lo più fisso e incorporato nella struttura dell'idrogel.Per una porzione più piccola del CT, che è mobile come nel campione preincubato e quindi osservata mediante NMR in soluzione, gli spettri mancano di segnali per i primi 10 residui strutturati, probabilmente a causa della difficile immobilizzazione della porzione attaccata di His-NT2Rep.Gli spettri NMR dello stato degli idrogel -NT2RepCT hanno rivelato la presenza predominante di α-eliche e strati β e, in misura minore, la conformazione a spirale casuale (Fig. 4b).L'analisi dello spostamento chimico dei residui di metionina presenti solo in NT ha mostrato che questo dominio era stato convertito in una struttura a foglio β.Gli spettri dipendenti dal tempo di NT in soluzione hanno mostrato una diminuzione uniforme dell'intensità del segnale (Fig. 4c) e l'NMR allo stato solido degli idrogel NT ha mostrato che la maggior parte dei residui NT sono stati convertiti in strutture a foglio β (Fig. 4d).La conformazione di 2Rep non può essere determinata separatamente a causa della sua tendenza ad aggregarsi.Tuttavia, gli spettri NMR allo stato solido degli idrogel NTCT e His-NT2RepCT sembravano molto simili (Fig. 4b; Fig. 6b supplementare), suggerendo che 2Rep ha contribuito poco alla parte strutturale dell'idrogel His-NT2RepCT.Per gli idrogel CT, sono state trovate eliche α, fogli β e strutture secondarie elicoidali casuali (Figura 6d supplementare).Ciò suggerisce che alcune parti del CT rimangono α-eliche mentre altre diventano β-fogli.Pertanto, i risultati della spettroscopia NMR suggeriscono che NT è importante per la formazione di idrogel e si trasforma anche in una conformazione a foglio β dopo la fusione con 2Rep e CT.Coerentemente con ciò, abbiamo recentemente scoperto che le cerniere spaziali amiloidi probabilmente si formano in tutte e cinque le eliche del dominio NT e l'algoritmo Waltz ha predetto una regione amiloidogenica nell'elica 1 (Fig. 4e).
Spettri 2D della soluzione His-NT2RepCT di 15N-HSQC 10 mg/ml prima (blu) e 19 ore dopo l'incubazione (rosso) a 37°C.I singoli picchi incrociati nello spettro rosso e F24, G136, poliA nello spettro blu sono indicati con simboli di amminoacidi a lettera singola e numeri di residui.Gli inserti mostrano la dipendenza dell'intensità del segnale dal tempo per i residui selezionati dei domini NT, 2Rep e CT.b Spettri di radiofrequenza allo stato solido (RFDR) di idrogel His-NT2RepCT.Le correlazioni dei residui Cα/Cβ osservati negli spettri RFDR sono state determinate confrontando gli spostamenti chimici dei peptidi modello e i valori derivati ​​dalle statistiche82,83 e dalle loro strutture secondarie.SSB – banda laterale rotante.c Spettri unidimensionali della soluzione NT 15N-HSQC 10 mg/ml durante l'incubazione a 37 °C per 36 ore.L'inserto mostra l'intensità volumetrica in funzione del tempo.d Spettri RFDR allo stato solido di idrogel NT.Sono indicate le correlazioni dei residui Cα/Cβ e delle loro strutture secondarie osservate negli spettri RFDR.e Basato sul profilo di propensione alla fibrillazione NT45.79 dal database Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).L'energia Rosetta della finestra spaziale di spostamento del fulmine dell'esapeptide è mostrata in kcal/mol.Le barre rosse indicano esapeptidi con un'elevata propensione alla fibrosi (energia di Rosetta inferiore a -23 kcal/mol; sotto la linea tratteggiata).Le barre verdi indicano frammenti con energie di Rosetta sopra la soglia e quindi con meno probabilità di formare cerniere steriche.I frammenti contenenti prolina sono stati esclusi dall'analisi (senza colonne).I quadrati indicano le aree di amiloidosi previste dall'algoritmo Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).La sequenza dei residui aminoacidici di NT è in alto, e i tipi di residui presenti nella struttura secondaria β (determinati mediante spettroscopia NMR allo stato solido) sono mostrati in rosso.Le posizioni delle cinque eliche α NT sono designate come (H1-H5)28.
A pH <6,5, HT dimerizza, essendo resistente alla denaturazione indotta dal calore o dall'urea18.Per chiarire in che modo la dimerizzazione e la stabilità dell'NT influiscono sulla gelificazione, le soluzioni contenenti 100 mg/ml di NT sono state controllate a pH 8, 7 e 6 utilizzando il test di inversione della fiala.I campioni NT incubati a pH 8 e 7 gelificarono dopo 30 minuti a 37 ° C, ma il gel a pH 8 rimase limpido, mentre il gel a pH 7 mostrava un precipitato visibile (Fig. 5a).Al contrario, una soluzione contenente HT a pH 6 non formava un gel e si poteva osservare un grande precipitato dopo 20 minuti a 37°C.Ciò suggerisce che i dimeri stessi e/o la loro maggiore stabilità rispetto ai monomeri impediscono la gelificazione.Non era prevista la formazione di un precipitato per NT a pH 7 e 6, poiché è stato riportato che NT è solubile a 200 mg/ml27, si ripiega facilmente dopo denaturazione termica e mantiene anche un'α-elica a valori inferiori di pH 18. Una probabile spiegazione per queste discrepanze è che gli esperimenti precedentemente riportati sono stati condotti a temperatura ambiente o inferiore, o a concentrazioni proteiche relativamente basse16,18,19.
Test di inversione della fiala NT (100 mg/mL) a pH 8, 7, 6 e NaCl 154 mM (pH 8) dopo incubazione a 37°C.b Spettri CD NT con e senza NaF 154 mM e NaCl 154 mM, rispettivamente.L'ellitticità molare a 222 nm viene convertita in una proporzione di pieghe naturali.c Test di inversione NT (100 mg/ml) NT* (37 °C e 60 °C), NTA72R (37 °C) e His-NT-L6 (37 °C e 60 °C).d Spettri CD dei mutanti NT NT*, NTA72R e His-NT-L6.L'ellitticità molare a 222 nm viene convertita in una proporzione di pieghe naturali.e Test di inversione di NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp ridotto (100 mg/mL).Barra della scala 5 mm.f Spettri CD di NT, NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp ridotto.L'ellitticità molare a 222 nm viene convertita in una proporzione di pieghe naturali.Gli spettri NT completi a 25 ° C e 95 ° C sono mostrati nella Figura 8 supplementare.
La concentrazione fisiologica del sale determina le interazioni elettrostatiche tra le subunità NT e la dimerizzazione del trasferimento di NT a pH inferiore 18.Abbiamo scoperto che la presenza di NaCl e NaF 154 mM inibiva effettivamente la gelificazione, rispettivamente (Fig. 5a, b; Figura 2b supplementare) e che questi sali aumentavano la stabilità termica dei monomeri NT (Figura 5b, Figura 8 supplementare) .Suggerisce inoltre che il miglioramento della stabilità, piuttosto che la dimerizzazione, previene la formazione di gel.
Per esplorare ulteriormente il ruolo della dimerizzazione e della stabilità delle proteine ​​nella gelificazione, abbiamo utilizzato due mutanti, NT* e NTA72R, che rimangono monomerici anche a pH basso 28,30.NT* è un mutante con doppia inversione di carica in cui l'apparente distribuzione dipolare della carica del monomero è appiattita, il che impedisce la dimerizzazione e aumenta drasticamente la stabilità del monomero.NTA72R è un dipolo carico, ma Ala sostituita con Arg si trova al confine del dimero, quindi le mutazioni interferiscono con le interazioni delle subunità necessarie per la dimerizzazione.Dopo incubazione a 37°C, NT* non ha formato un idrogel, mentre NTA72R ha formato un gel opaco per 15 minuti (Fig. 5c).Poiché sia ​​NT* che NTA72R non possono dimerizzare ma differiscono nella stabilità del monomero (Fig. 5d), questi risultati suggeriscono fortemente che un'elevata stabilità termodinamica impedisce la gelificazione dell'NT.Ciò è supportato anche dal fatto che HT* forma un gel quando è instabile ad alta temperatura (dopo 8 minuti a 60°C; Fig. 5c).È stato precedentemente dimostrato che l'alto contenuto di metionina nell'NT liquefa il suo ripiegamento naturale e che sei sostituti Met to Leu (qui indicati come His-NT-L6) stabilizzano fortemente il monomero NT46.Basandosi sul presupposto che è necessaria flessibilità strutturale per la formazione del gel NT, abbiamo scoperto che il mutante stabile His-NT-L6 non gelificava a 37 ° C (Figura 5c, d).Tuttavia, His-NT-L6 ha anche formato un gel dopo incubazione a 60°С per 60 minuti (Fig. 5c).
La capacità delle NT di trasformarsi in strutture a foglietto β e formare idrogel sembra applicarsi ad alcuni ma non a tutti i domini NT della spidroina.NT di diversi tipi di seta e specie di ragno, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formavano gel nonostante il loro contenuto di metionina relativamente basso e l'elevata stabilità termica (Fig. 5e, f e Tabella supplementare 2).Al contrario, l'NT della piccola spidroina proteica ampollare di Araneus ventricosus (NTMiSp) con bassa stabilità termica e alto contenuto di metionina non formava idrogel (Tabella supplementare 2 e Fig. 5e, f).Quest'ultimo può essere associato alla presenza di legami disolfuro intramolecolari29,47.Coerentemente, quando i legami disolfuro di NTMiSp venivano ridotti, formava un idrogel dopo incubazione a 37°C per 10 minuti (Fig. 5e).In conclusione, va notato che la flessibilità strutturale è un criterio importante, ma non l'unico, per la formazione di un gel da NT.Un altro fattore che potrebbe essere rilevante è la propensione a formare fibrille amiloidi e l'analisi con il database Zipper e l'algoritmo Waltz hanno mostrato una correlazione tra la capacità di formare gel e la presenza di regioni amiloidogeniche, nonché l'estensione delle regioni previste per formare cerniere steriche.C'era una correlazione (Tabella supplementare 2 e Figura supplementare 9).
La capacità delle NT di formare fibrille e gel in condizioni favorevoli ci ha portato a ipotizzare che le fusioni di NT con altri frammenti proteici possano ancora formare gel con piena funzione di partner di fusione.Per testare questo, abbiamo introdotto la proteina fluorescente verde (GFP) e la fosforilasi nucleosidica purina (PNP) rispettivamente al C-terminale dell'NT.Le proteine ​​di fusione risultanti sono state espresse in E. coli con rese finali molto elevate (colture in matraccio agitato da 150 mg/L e 256 mg/L rispettivamente per His-NT-GFP e His-NT-PNP), in linea con quanto dimostrato per Altre proteine ​​fuse con NT Rif.30. Le proteine ​​di fusione His-NT-GFP (300 mg/ml) e His-NT-PNP (100 mg/ml) hanno formato gel dopo 2 ore e 6,5 ore a 37°C e, cosa importante, la frazione GFP è rimasta invariata.osservato dopo la gelificazione, con> 70% dell'intensità della fluorescenza iniziale rimanente dopo la gelificazione (Fig. 6a).Per misurare l'attività PNP nelle soluzioni e nei gel his-NT-PNP, abbiamo dovuto diluire la proteina di fusione con NT perché l'attività enzimatica della preparazione pura era al di fuori dell'intervallo di rilevamento del test a concentrazioni gelificanti.Il gel formato con una miscela contenente 0,01 mg/mL di His-NT-PNP e 100 mg/mL di NT ha mantenuto il 65% dell'attività enzimatica iniziale dei campioni preincubati (Fig. 6b).Il gel è rimasto intatto durante la misurazione (Figura 10 supplementare).
a Intensità relativa della fluorescenza prima e dopo la gelificazione di His-NT-GFP (300 mg/mL) e fiala invertita contenente His-NT-GFP idrogel (300 mg/mL) sotto luce visibile e UV.I punti mostrano misurazioni individuali (n = 3), le barre di errore mostrano la deviazione standard.Il valore medio è mostrato al centro delle barre di errore.b L'attività PNP è stata ottenuta mediante analisi fluorimetrica utilizzando soluzioni e gel costituiti da NT (100 mg/ml) e una miscela contenente 0,01 mg/ml his-NT-PNP e 100 mg/ml nuovi dollari di Taiwan.L'inserto mostra una fiala capovolta contenente un idrogel contenente His-NT-PNP (barra di scala da 5 mm).
Qui riportiamo la formazione di idrogel da NT e altre proteine ​​spidroina ricombinanti incubando una soluzione proteica a 37°C (Figura 1).Mostriamo che la gelificazione è associata alla trasformazione delle eliche α in strati β e alla formazione di fibrille simili all'amiloide (Fig. 3 e 4).Questa scoperta è sorprendente poiché i NT sono fasci globulari a spirale a cinque eliche noti per la loro estremamente elevata solubilità ed elevata stabilità a concentrazioni >200 mg/mL a 4°C per diversi giorni27.Inoltre, gli NT si ripiegano facilmente dopo la denaturazione termica a basse concentrazioni proteiche in µM.Secondo i nostri risultati, la formazione di fibrille richiede una combinazione di concentrazione proteica >10 mg/mL e temperatura leggermente elevata (Fig. 1).Ciò è coerente con l'idea che le fibrille amiloidi possono formarsi da proteine ​​ripiegate globularmente che si trovano in uno stato parzialmente spiegato a causa delle fluttuazioni termiche in condizioni fisiologiche48.Esempi di proteine ​​che subiscono questa conversione includono insulina49,50, β2-microglobulina, transtiretina e lisozima51,52,53.Sebbene NT sia un'α-elica nel suo stato nativo, circa il 65% della catena polipeptidica è compatibile con la formazione di cerniere steriche (Fig. 4e) 45 .Poiché il monomero è dinamicamente mobile46, può esporre queste potenziali regioni amiloidogeniche a temperature moderatamente elevate e ad alte concentrazioni di proteine ​​totali può raggiungere una concentrazione critica per la formazione di fibrille amiloidi54.Seguendo questo ragionamento, abbiamo trovato una correlazione negativa tra la concentrazione di spidroina e il tempo di gelificazione (Fig. 1c), e se la conformazione monomerica NT è stabilizzata da mutazioni (NT*, His-NT-L6) o dall'aggiunta di sale, può impedire la formazione di idrogel (Fig. 5).
Nella maggior parte dei casi, le fibrille amiloidi scompaiono dalla soluzione sotto forma di precipitato, ma in determinate condizioni possono formare idrogel55,56,57.Le fibrille che formano idrogel hanno tipicamente un rapporto di aspetto elevato e formano reti tridimensionali stabili attraverso l'entanglement molecolare,55,58 in linea con i nostri risultati.Per la formazione di idrogel in vitro, le proteine ​​vengono spesso completamente o parzialmente dispiegate, ad esempio mediante esposizione a solventi organici, temperature elevate (70–90°C) e/o pH basso (1,5–3,0)59,60,61,62.Gli idrogel di spidroina qui descritti non richiedono una lavorazione dura, né richiedono agenti reticolanti per stabilizzare gli idrogel.
È stato precedentemente riportato che le ripetizioni dello spidroin e i QD, che sembrano subire la commutazione del foglio β durante la filatura della seta, formano idrogel.Rispetto ai nostri risultati, i tempi di incubazione e/o le temperature di incubazione erano significativamente più lunghi o più alti, rispettivamente, e gli idrogel risultanti erano spesso opachi (Figura 7 e Tabella supplementare 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Oltre ai tempi di gelificazione rapidi, gli idrogel NT >300 mg/mL (30%) hanno sovraperformato tutti gli altri idrogel ricombinanti di proteine ​​della seta di ragno descritti, così come gli idrogel naturali come gelatina, alginato (2%), agar (0,5% ) e collagene.(0,6%) (Figura 7 e tabelle supplementari 1 e 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Il tempo di gelificazione e il modulo elastico degli idrogel in questo studio sono stati confrontati con altri idrogel a base di spidroina e idrogel naturali selezionati.Vengono forniti riferimenti insieme ad una descrizione delle condizioni di gelificazione.APS Persolfato di ammonio, temperatura ambiente.Dati 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Sembra che i ragni abbiano sviluppato modi per impedire alla spidroina di gelificarsi durante la conservazione.Nonostante l'elevata concentrazione di proteine ​​nella ghiandola della seta, l'ampia regione ripetuta associata al dominio terminale significa che la concentrazione apparente di NT e CT nella ghiandola corrisponde a circa 10-20 mg/ml, al limite di questo studio.richiesto per la formazione di idrogel osservata in vitro.Inoltre, concentrazioni simili di sali 16 hanno stabilizzato NT, come nelle ghiandole della seta (Fig. 5b).La conformazione dell'NT è stata studiata nel citosol di E. coli e si è scoperto che è piegata più strettamente rispetto a quando esaminata in vitro, indicando ulteriormente che il sale o altri fattori ne impediscono l'aggregazione in vivo.Tuttavia, la capacità delle NT di trasformarsi in fibrille di foglietti β può essere importante per la formazione dei filamenti e dovrebbe essere studiata in studi futuri.
Oltre ai nuovi aspetti della formazione di fibrille e idrogel simili a NT-amiloide osservati in questo studio, mostriamo anche che questo fenomeno può avere applicazioni biotecnologiche e biomediche (Fig. 8).Come prova di concetto, abbiamo combinato NT con GFP o PNP e abbiamo dimostrato che la proteina di fusione forma anche idrogel quando incubata a 37 ° C e che le frazioni GFP e PNP mantengono in gran parte la loro attività dopo la gelificazione (Figura 6).Le fosforilasi nucleosidici sono importanti catalizzatori per la sintesi di analoghi nucleosidici75, il che rende la nostra scoperta rilevante per l'industria biofarmaceutica.Il concetto di esprimere proteine ​​di fusione che formano idrogel trasparenti in condizioni favorevoli consente la creazione di idrogel funzionalizzati con proprietà favorevoli per un'ampia gamma di applicazioni come immobilizzazione enzimatica, rilascio controllato di farmaci e ingegneria tissutale.Inoltre, NT e NT* sono marcatori di espressione efficienti30, il che significa che NT e le sue varianti possono essere utilizzate per la produzione ad alto rendimento di proteine ​​di fusione solubili e la successiva creazione di proteine ​​bersaglio immobilizzate in idrogel 3D.
L'NT è solubile, α-elicoidale e stabile a basse concentrazioni (μM) e 37°C.Alla stessa temperatura, ma a concentrazioni crescenti (>10 mg/ml), la NT forma gel costituiti da fibrille simili all'amiloide.Le proteine ​​di fusione NT formano anche gel fibrillari con frammenti di fusione completamente funzionali, consentendo a varie proteine ​​di essere immobilizzate in idrogel 3D utilizzando NT.In basso: NT (PDB: 4FBS) e illustrazioni delle reti di fibre e delle strutture proteiche associate (presunte e non disegnate in scala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
I costrutti (vedere la Tabella Supplementare 4 per un elenco completo che include sequenze di amminoacidi) sono stati clonati nel plasmide pT7 e trasformati in E. coli BL21 (DE3).E. coli contenenti plasmidi ingegnerizzati sono stati inoculati in brodo Luria arricchito con kanamicina (70 mg/l) e fatti crescere durante la notte a 30°C e 250 giri al minuto.La coltura è stata quindi inoculata 1/100 in terreno LB contenente kanamicina e coltivata a 30°C e 110 giri al minuto finché la OD600 ha raggiunto 0,8.Per gli studi NMR, i batteri sono stati coltivati ​​in terreno minimo M9 contenente 2 g di D-glucosio 13C (Aldrich) e 1 g di cloruro di ammonio 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) per la marcatura delle proteine ​​con isotopi.Abbassare la temperatura a 20 gradi Celsius e indurre l'espressione proteica con isopropiltiogalattopiranoside 0,15 mM (concentrazione finale).Dopo l'espressione proteica durante la notte, le cellule sono state raccolte a 7278×g, 4°C per 20 minuti.I pellet cellulari sono stati risospesi in Tris-HCl 20 mM, pH 8, e congelati fino a ulteriore utilizzo.Le cellule scongelate sono state lisate utilizzando un disgregatore cellulare (macchine della serie TS, Constant Systems Limited, Inghilterra) a 30 kPa.Quindi i lisati sono stati centrifugati a 25.000 g per 30 minuti a 4°C.Per NTMiSp, il pellet è stato quindi risospeso in urea 2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8 e sonicato per 2 minuti (2 s on/off, 65%), quindi centrifugato nuovamente a 25.000 xg, 4° C. entro 30 minuti.Il surnatante è stato caricato su una colonna Ni-NTA, lavato con Tris-HCl 20 mM, imidazolo 2 mM, pH 8, e infine la proteina è stata eluita con Tris-HCl 20 mM, imidazolo 200 mM, pH 8. Per generare NT2RepCT e NTCT, la digestione della trombina introduce il sito (ThrCleav) tra His e NT.I siti di clivaggio della trombina sono presenti anche in His-NT-ThrCleav-2Rep (produce 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produce NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produce CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produce NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produce NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produce NTF1Sp) e His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produce NTMiSp).I costrutti sono stati digeriti con trombina (1:1000) e dializzati durante la notte a 4°C con Tris-HCl 20 mM, pH 8, utilizzando una membrana per dialisi Spectra/Por con una soglia di peso molecolare di 6-8 kDa.Dopo la dialisi, la soluzione viene caricata su una colonna Ni-NTA e viene raccolto l'effluente contenente la proteina di interesse.Le concentrazioni proteiche sono state determinate misurando l'assorbanza UV a 280 nm utilizzando il coefficiente di estinzione di ciascuna proteina, ad eccezione di NTF1Sp, che ha utilizzato il test Bradford secondo il protocollo del produttore.La purezza è stata determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (4-20%) SDS e colorazione blu brillante con Coomassie.Le proteine ​​sono state concentrate utilizzando filtri centrifughi (VivaSpin 20, GE Healthcare) a 4000 xg con un limite di peso molecolare di 10 kDa in cicli di 20 minuti.
Scongelare la soluzione proteica e pipettare con attenzione 150 µl in una fiala con setto trasparente da 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Le provette sono state tappate e sigillate con parafilm per prevenire l'evaporazione.I campioni (n = 3) sono stati incubati a 37°C o 60°C e periodicamente capovolti per osservare la gelificazione.I campioni che non gelificavano sono stati incubati per almeno una settimana.Ridurre i legami disolfuro NTMiSp con DTT da 10 mM per proteina da 10 µM.Per analizzare la gelificazione dei rivestimenti naturali in seta di ragno, il ragno ponte svedese è stato tagliato, le due ghiandole principali ampullate sono state poste in 200 μl di tampone Tris-HCl 20 mM pH 8 e tagliate per consentire al rivestimento di separarsi dalle ghiandole..Il contenuto delle ghiandole viene sciolto in tampone, 50 µl per la determinazione del peso secco (mediante incubazione di fiale aperte a 60 °C fino a peso costante) e 150 µl per la gelificazione a 37 °C.
La geometria/strumento di misura è realizzata in acciaio inossidabile utilizzando una piastra parallela con un diametro superiore di 20 mm e una distanza di 0,5 mm.Riscaldare il campione da 25 °C a 45 °C e poi di nuovo a 25 °C a una velocità di 1 °C al minuto utilizzando una piastra Peltier con fondo in acciaio inossidabile.Le misurazioni delle vibrazioni sono state effettuate ad una frequenza di 0,1 Hz e nella regione viscoelastica lineare del materiale con una deformazione del 5% e dello 0,5% per campioni rispettivamente di 100 mg/ml e 300-500 mg/ml.Utilizzare una camera umida personalizzata per prevenire l'evaporazione.I dati sono stati analizzati utilizzando Prism 9.
Per la raccolta di spettri infrarossi (IR) a temperatura ambiente da 800 a 3900 cm–1.Il dispositivo ATR, così come il percorso della luce attraverso lo spettrometro, vengono spurgati con aria secca filtrata prima e durante l'esperimento.Le soluzioni (500 mg/ml per ridurre al minimo i picchi di assorbimento di acqua negli spettri) sono state pipettate sui cristalli e i gel (500 mg/ml) sono stati formati prima della misurazione e quindi trasferiti ai cristalli (n = 3).Sono state registrate 1000 scansioni con una risoluzione di 2 cm-1 e ciclo di lavoro pari a zero di 2. La derivata seconda è stata calcolata utilizzando OPUS (Bruker) utilizzando un intervallo di livellamento di nove punti.Gli spettri sono stati normalizzati alla stessa regione di integrazione tra 1720 e 1580 cm-1 utilizzando “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” di F. Menges.Nella spettroscopia ATR-IR, la profondità di penetrazione di un raggio infrarosso in un campione dipende dal numero d'onda, con conseguente maggiore assorbimento a numeri d'onda inferiori rispetto a numeri d'onda superiori.Questi effetti non sono stati corretti per gli spettri mostrati nelle Figg.3 perché sono molto piccoli (Figura 4 supplementare).Gli spettri corretti per questa figura sono stati calcolati utilizzando il software Bruker OPUS.
In linea di principio, una quantificazione completa delle conformazioni proteiche è possibile dopo una deconvoluzione affidabile dei componenti all'interno del picco dell'ammide I.Tuttavia, nella pratica si presentano alcuni ostacoli.Il rumore nello spettro può apparire come (falsi) picchi durante la deconvoluzione.Inoltre, il picco dovuto alla flessione dell'acqua coincide con la posizione del picco dell'ammide I e può avere una grandezza simile per campioni contenenti una grande quantità di acqua, come il gel acquoso qui studiato.Pertanto, non abbiamo tentato di decomporre completamente il picco dell'ammide I e le nostre osservazioni dovrebbero essere considerate solo a supporto di altri metodi come la spettroscopia NMR.
Soluzioni di 50 mg/ml di NT e His-NT2RepCT sono state gelificate durante la notte a 37°C.L'idrogel è stato quindi diluito con Tris-HCl 20 mM (pH 8) ad una concentrazione di 12,5 mg/ml, agitato bene e pipettato per rompere il gel.Successivamente, l'idrogel è stato diluito 10 volte con Tris-HCl 20 mM (pH 8), 5 μl del campione sono stati applicati su una griglia di rame rivestita con formvar e il campione in eccesso è stato rimosso con carta assorbente.I campioni sono stati lavati due volte con 5 µl di acqua MilliQ e colorati con formiato di uranile all'1% per 5 minuti.Rimuovere la macchia in eccesso con carta assorbente, quindi asciugare la rete all'aria.L'imaging è stato eseguito su queste griglie utilizzando un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN operante a 100 kV.Le immagini sono state registrate a x 26.500 e x 43.000 ingrandimenti utilizzando una fotocamera CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germania).Per ciascun campione (n = 1), sono state registrate 10-15 immagini.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) è stato utilizzato per l'analisi delle immagini e la misurazione dei diametri delle fibre (n = 100, fibre diverse).Il prisma 9 è stato utilizzato per eseguire test t non accoppiati (a due code).La media delle fibrille His-NT2RepCT e NT era rispettivamente di 11,43 (SD 2,035) e 7,67 (SD 1,389) nm.L'intervallo di confidenza (95%) è compreso tra -4,246 e -3,275.gradi di libertà = 198, p < 0,0001.
80 µl di campioni liquidi contenenti 10 µM di tioflavina T (ThT) sono stati misurati in triplicato (n = 3) in condizioni statiche utilizzando piastre Corning a fondo trasparente da 96 pozzetti con fondo nero (Corning Glass 3881, USA).Le differenze di fluorescenza sono state registrate utilizzando un filtro di eccitazione da 440 nm e un filtro di emissione da 480 nm (FLUOStar Galaxy di BMG Labtech, Offenburg, Germania).Il segnale ThT non era né saturato né spento, poiché sono stati eseguiti esperimenti con diverse concentrazioni di ThT senza modificare l'intensità del segnale.Registrare l'assorbanza a 360 nm per la misurazione della foschia.Per gli esperimenti di semina, sono stati formati gel da 100 mg/mL a 37°C, risospesi e utilizzati per la semina a rapporti molari del 5%, 10% e 20%.I dati sono stati analizzati utilizzando Prism 9.
Scongelare le scorte di His-NT2RepCT e NT >100 mg/mL su ghiaccio e filtrare attraverso un filtro da 0,22 µm.Le concentrazioni sono state calcolate misurando l'assorbanza a 280 nm utilizzando Nanodrop.Nei pozzetti di una piastra nera non legante da 96 pozzetti (Corning) con fondo trasparente, i campioni sono stati diluiti a 20 mg/ml in Tris-HCl 20 mM pH 8 e miscelati con ThT 5 μM (concentrazione finale), concentrazione totale del campione Volume di 50 µl.I campioni sono stati sottoposti a imaging ogni 10 minuti a 37 ° C su un microscopio CellObserver (Zeiss) con canale a luce trasmessa e set di filtri di eccitazione ed emissione FITC per l'imaging ThT.Per l'imaging viene utilizzata una lente 20x/0,4.Zen Blue (Zeiss) e ImageJ (https://imagej.nih.gov/) sono stati utilizzati per l'analisi delle immagini.Sono stati preparati anche gel da soluzioni NT e His-NT2RepCT ad una concentrazione di 50 mg/mL contenenti 20 mM Tris pH 8 e 5 µM ThT e incubati a 37°C per 90 minuti.I pezzi di gel sono stati trasferiti in un nuovo pozzetto contenente 20 mM di Tris, pH 8 e 5 μM di ThT in una piastra inferiore trasparente nera a 96 pozzetti non legante.Acquisire immagini in fluorescenza verde e in campo chiaro con ingrandimento 20x/0,4.ImageJ è stato utilizzato per l'analisi delle immagini.
Gli spettri NMR in soluzione sono stati ottenuti a 310 K su uno spettrometro Bruker Avance Neo da 600 MHz dotato di una criosonda a campo a gradiente pulsato a risonanza quadrupolare QCI (HFCN).Campioni NMR contenenti 10 mg/mL di proteina omogenea marcata con 13C, 15N, disciolta in Tris-HCl 20 mM (pH 8), 0,02% (p/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Gli spostamenti chimici di NT2RepCT a pH 6,7 sono stati utilizzati per assegnare il picco 23 nello spettro 2D di 15N-HSQC.
Gli spettri NMR (MAS) solidi con filatura ad angolo magico di idrogel marcati 13C, 15N sono stati registrati su uno spettrometro Bruker Avance III HD a 800 MHz dotato di una sonda priva di elettroni 13C/15N{1H} da 3,2 mm.La temperatura del campione è stata controllata utilizzando un flusso di gas a temperatura variabile a 277 K. Gli spettri di risonanza rotazionale dipolo bidimensionale (DARR)76 e di riconnessione a radiofrequenza (RFDR)77 sono stati acquisiti a frequenze MAS di 12,5 kHz e 20 kHz, rispettivamente.La polarizzazione incrociata (CP) da 1H a 13C è stata eseguita utilizzando una rampa lineare da 60,0 a 48,0 kHz a 1H, 61,3/71,6 kHz a 13C (a 12,5/20 kHz MAS) e tempo di contatto 0,5–1 ms.Durante la raccolta dei dati è stato utilizzato il disaccoppiamento Spinal6478 a 73,5 kHz.Il tempo di acquisizione era di 10 millisecondi e il ritardo del ciclo era di 2,5 secondi.Le correlazioni Cα/Cβ a collegamento singolo osservate negli spettri RFDR sono state assegnate in base ai caratteristici spostamenti chimici del tipo di residuo e alle correlazioni a collegamento multiplo negli spettri DARR.
Il database Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) è stato utilizzato per valutare le tendenze al flutter e l'energia di Rosetta per NT, NTFlSp e NTMiSp.Il database Zipper calcola Rosetta Energy80, che combina diverse funzioni di energia libera per modellare e analizzare la struttura delle proteine.Un livello energetico pari o inferiore a -23 kcal/mol indica un'elevata tendenza alla fibrillazione.L'energia inferiore significa maggiore stabilità dei due filamenti β nella conformazione a cerniera.Inoltre, l'algoritmo Waltz è stato utilizzato per prevedere le regioni amiloidogeniche in NT, NTFlSp e NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
La soluzione proteica NT è stata miscelata con tampone di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES) a pH 5,5 e 6,0 per abbassare il pH rispettivamente a pH 6 e 7.La concentrazione proteica finale era di 100 mg/ml.
Le misurazioni sono state eseguite su uno spettrometro CD J-1500 (JASCO, USA) utilizzando una cuvetta da 300 μL con un percorso ottico di 0,1 cm.Le proteine ​​sono state diluite a 10 μM (n = 1) in tampone fosfato 20 mM (pH 8).Per analizzare la stabilità delle proteine ​​in presenza di sale, le proteine ​​sono state analizzate alla stessa concentrazione (n = 1) in tampone fosfato 20 mM (pH 8) contenente rispettivamente 154 mM NaF o NaCl.Le scansioni della temperatura sono state registrate a 222 nm da 25°C a 95°C con una velocità di riscaldamento di 1°C/min.La proporzione di proteine ​​ripiegate in modo nativo è stata calcolata utilizzando la formula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Inoltre, sono stati registrati cinque spettri per ciascun campione da 260 nm a 190 nm a 25°C e dopo riscaldamento a 95°C.È stata calcolata la media di cinque spettri, livellati e convertiti in ellitticità molare.I dati sono stati analizzati utilizzando Prism 9.
L'intensità della fluorescenza di His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) è stata misurata in triplicato (n = 3) in piastre Corning da 96 pozzetti con fondo nero trasparente (Corning Glass 3881, USA) in condizioni statiche.Misurare i campioni con un lettore di piastre a fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 395 nm e registrare l'emissione a 509 nm prima della gelificazione e 2 ore dopo a 37°C.I dati sono stati analizzati con Prism 9.
Il kit per il test dell'attività della fosforilasi nucleosidica delle purine (metodo fluorimetrico, Sigma Aldrich) è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore.Per misurare l'attività nei gel e nelle soluzioni contenenti His-NT-PNP, mescolare 10 ng di His-NT-PNP con 100 mg/mL NT fino a un volume totale di 2 µ l perché il gel ha dato un segnale al di sopra dell'intervallo di rilevamento del set.Sono stati inclusi controlli per gel e soluzioni senza His-NT-PNP.Le misurazioni sono state effettuate due volte (n = 2).Dopo che l'attività è stata misurata, la miscela di reazione è stata rimossa e il gel è stato fotografato per garantire che il gel rimanesse intatto durante la misurazione.I dati sono stati analizzati utilizzando Prism 9.
Per ulteriori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'abstract dello studio Nature collegato a questo articolo.
Le figure 1 e 2 presentano i dati iniziali.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f e 6, figure supplementari.3, fig.5a, d, fig.6 e fig.8. Dati I dati di questo studio sono ospitati nel database Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.I dati NMR ottenuti in questo studio sono stati pubblicati nell'archivio BMRBig con l'ID voce bmrbig36.Le strutture di GFP e PNP sono state prese da PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
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